一、材料
【仪器设备】超净工作台、滤器、CO2 培养箱、电热干燥箱
【器械及器皿】培养瓶、培养皿、滴管、镊子、手术剪
【试剂】:常用培养基还有：DMEM-高糖、DMEM-低糖、DMEM/F12、RPM1640、MEM、M-199等，可根据培养需求合理选择。
血清:一般常用为胎牛血清，人血清和其它动物血清。
平衡盐溶液:主要用于作为稀释和灌注的液体,维持细胞渗透压，提供缓冲系统，使培养液的酸碱度维持在培养细胞生理范围内，提供细胞正常代谢所需的水分和无机离子等。常用的有PBS，Hank's 等。
抗生素:常用为青霉素和链霉素。
其它添加成分:缓冲系统，常用为HEPES，在 20 度时为 7.55；37 度为7.31; HEPES 不是起维持 PH 恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速 PH 变化的，所以调整 PH 常常用 NaHCO3 溶液。
有机补充物,如丙酮酸钠，谷氨酰胺等。促细胞分裂因子，如生长因子类的 FGF、EDF。贴璧和铺展因子，如胶原蛋白，纤粘蛋白等。
怀孕的母鼠、多聚赖氨酸、0.25% 胰酶、70-75% 酒精溶液。
二、步骤
1、胚鼠原代培养
1.1 实验前，超净工作台或生物安全柜紫外灯提前照射 30 分钟；
1.2 取材:取怀孕母鼠，颈椎脱臼法处死后，整个鼠体浸入盛有纯酒精的烧杯中浸泡 1 分钟。取出母鼠在不锈钢手术盘中用无菌手术剪打开腹腔，取出鼠胚，放入无菌培养皿内。注意取材可在无菌操作台外操作。
1.3 用 70-75% 酒精擦拭装有鼠胚的培养皿外周后，将培养皿移至超净工作台或生物安全柜中，用含双抗 Hanks 液洗涤鼠胚数遍却除血污。在体视显微镜下进行操作，用无菌手术器械去除多余组织，用解剖镊剖取需要的组织，移入含解离液或培养基的 50 ml 离心管中，用眼科剪将组织剪碎成1立方毫米的肉糜状；
1.4 在含组织的 50 ml 离心管中加入解离液或培养基至 10 ml。首先用 10 ml弯头滴管对组织进行吹打 5-10 次，然后用 1 ml 枪头的吹打组织，最后用 200 μl 的尖端进行吹打；
1.5 将上述组织悬液通过 70 μm 过滤器过滤切碎和分散的组织悬浮液，然后 l200 rpm， 4℃ 离 10 分钟；
1.6 弃掉上清，加入配置好的细胞培养基重悬细胞，接种于经多聚赖氨酸预处理的培养瓶或培养板中，将其置于于 37℃、5% CO2 培养箱中，三天后换液，以后每两天换细胞培养液；
2、传代培养
2.1 实验前，超净工作台或生物安全柜紫外灯提前照射 30 min，开始实验时，酒精擦拭消毒双手；
2.2 将原代培养的培养瓶倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代培养；
2.3 用酒精棉球擦净操作台，点燃酒精灯，将培养瓶口灼烧消毒；
2.4 倒掉培养瓶中的旧培养基，留下贴壁生长的细胞；
2.5 在培养瓶中加入适量 0.25 % 胰酶至刚好漫过贴壁生长的细胞即可，拧上瓶盖，将培养瓶置于37℃的培养箱中 5 min。在此期间，如果在显微镜下观察可以看到细胞收回突起变成圆形。
2.6 取出培养瓶,轻轻摇晃培养瓶或吹打使细胞脱离瓶壁，将细胞悬液移至离心管中，4℃、800 rpm离心 5 min；
2.7 弃掉离心管中的上清，加入细胞培养基重悬细胞植于多聚赖氨酸预处理的培养瓶或培养板，再将其置于37℃、5% CO2培养箱中培养，此时细胞可以继续分裂而传代。
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