流式细胞术检测——细胞外囊泡

一、核心原理

        流式细胞术检测EVs的基本原理与传统检测细胞类似，可以概括为：使单颗粒的EVs在鞘液包裹下高速直线通过激光检测区，通过检测其产生的散射光和荧光信号，对EVs进行多参数、高通量的定量与分析。

其工作流程和关键环节如下：

1. 样本制备与标记：EVs样本（如血浆、细胞上清）通常先用特异性荧光抗体（如针对CD9、CD63、CD81等EVs表面标志物）或膜染料（如PKH67、DiI）进行标记。

2. 流体聚焦：样本被注入流动室，在鞘液的包裹和挤压下，形成极细的样本流，使EVs单行排列，逐个通过激光检测点。这是实现“单颗粒”检测的关键。

3. 激光照射：单颗EVs通过激光束（通常是蓝光488nm激光）时，会发生相互作用。

4. 信号检测：

       ○  前向散射光（FSC）：与颗粒的大小/体积相关。颗粒越大，FSC越强。

       ○  侧向散射光（SSC）：与颗粒的内部复杂度（如颗粒形态、内部结构） 相关。颗粒内部越不规则，SSC越强。

       ○  散射光：

       ○  荧光：如果EVs携带荧光标记（如抗体-荧光素偶联物），被激光激发后会发射特定波长的荧光。通过不同的滤光片和检测器，可以同时检测多种荧光（如FITC、PE、APC），实现对不同表面蛋白的多色分析。

5. 信号转换与数据分析：光电倍增管将光信号转换为电信号，再数字化为数据点。每个EVs对应数据图上的一个点（通常以FSC、SSC和荧光强度为坐标），通过设门（Gating）策略，可以识别和统计特定亚群的EVs。

二、用于检测EVs时面临的核心挑战与应对策略

EVs（尤其是小型的外泌体，直径约30-150nm）的物理特性给传统流式细胞仪带来了巨大挑战：

1. 尺寸极限：

       ○  使用荧光信号为主：相比微弱的散射光，荧光信号更强、特异性更高。因此，EVs流式分析严重依赖荧光标记，通过阳性荧光信号来识别EVs。

       ○  高灵敏度流式细胞仪：专门用于纳米颗粒检测的纳米流式细胞仪（如nFCM） 或 高通量光谱流式细胞仪。它们采用更强大的激光、更灵敏的光子检测器（如PMT/APD）和优化的光路系统，能够检测低至40-70nm颗粒的散射光，实现了真正的“单颗粒”检测。

       ○  挑战：传统流式细胞仪的设计主要针对细胞（微米级），其检测下限通常为300-500nm。大部分EVs小于这个尺寸，其产生的散射光信号接近或低于仪器的背景噪音（来自鞘液、电子噪音等），难以分辨。

2. “Swarm”效应：

       ○  挑战：当EVs浓度过高时，多个EVs可能同时通过激光束，被检测器记录为一个“大颗粒”信号，导致计数偏低、信号值虚高。

       ○  应对策略：必须将样本稀释到合适浓度（通常通过预实验确定），确保是真正的单颗粒检测。

3. 杂质干扰：

       ○  特异性标记：使用EVs特异性标志物（如CD63、CD81、TSG101等）的抗体进行标记，区分非EVs颗粒。

       ○  多重标记策略：采用两个或以上EVs标志物共标（如CD63+CD81+），可以更可靠地鉴定真正的EVs群体，排除非特异性结合。

       ○  样本纯化：检测前通过尺寸排阻色谱、超速离心等方法纯化EVs，但需注意这些方法可能导致EVs损失或改变。

       ○  挑战：生物样本中常含有蛋白质聚集体、脂蛋白（如乳糜微粒、LDL/HDL）等与EVs尺寸重叠的杂质。

三、标准检测流程与数据分析要点

1. 仪器校准：使用已知大小和荧光强度的标准微球（如100nm、200nm、500nm纳米微球）校准仪器，确定检测阈值和灵敏度。

2. 设置对照：

       ○  未染色对照：确定自发荧光背景。

       ○  同型对照：评估抗体非特异性结合。

       ○  阴性样本对照：如不含EVs的缓冲液，用于设定背景噪音阈值。

3. 数据获取与设门：

       ○  首先在FSC/SSC散点图中，根据标准微球的位置，设定一个包含目标EVs大小的“颗粒门”（P1）。

       ○  然后，在荧光通道中，根据阴性对照设定荧光阳性阈值。只有当颗粒同时落在“颗粒门”内且荧光信号超过阈值时，才被计为特异性阳性的EVs。

       ○  对于多色分析，可以使用十字门或更复杂的逻辑门组合来鉴定特定标志物组合的EVs亚群。

四、优势与局限性

  ○  优势：

        ○ 高通量：每秒可分析成千上万个颗粒，统计效能高。

        ○ 多参数：可同时分析多个表面标志物。

        ○ 定量：提供绝对计数和比例信息。

        ○ 识别异质性：能够分辨EVs的不同亚群。

  ○  局限性：

        ○ 灵敏度限制：即使使用纳米流式，对极小（<40nm）或折射率低的EVs检测仍有困难。

        ○ 无法直接观察形态：不能像电镜那样提供形态学确认。

        ○ 存在“Swarm”效应风险：需精细优化实验条件。

        ○ 抗体依赖性和特异性问题：标记效率、抗体特异性直接影响结果。

总结

        流式细胞术检测EVs的原理，本质上是将超微颗粒的检测推向了传统流式技术的能力边界。现代解决方案（特别是纳米流式细胞术和高参数光谱流式）通过提升灵敏度、降低背景，并结合多重荧光标记策略，已经使其成为研究EVs表面标志物表达、异质性和定量分析的强大工具。然而，严谨的实验设计、严格的对照设置和准确的数据解读对于获得可靠结果至关重要。

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