双侧外耳缺失伴发外耳道闭锁猪模型

一、研究背景

小耳畸形的病因目前还不完全明确，环境和遗传因素是目前小耳畸形病因研究的重点。小耳畸形主要涉及胚胎发育期间第一和第二鳃弓的异常，主要表型涉及外耳发育异常。外耳的耳廓是由第一和第二鳃弓的逐渐融合形成的，在发育过程中第一和第二鳃弓之间是相互作用，两弓之间的凹槽加深，形成外耳道。

小耳畸形主要是指外耳的先天发育性结构异常，其严重程度主要表现为从轻度结构异常到完全性耳廓缺失，并且可伴有外耳道狭窄和外耳道闭锁等一系列先天性外耳异常，轻者耳廓略小于正常， 畸形严重者耳廓全部消失， 绝大多数患者仅遗留花生状或贝壳状的残耳组织。同时一些小耳畸形患者也常合并颅面部畸形，中耳及半侧颜面骨及软组织发育不良等。

HOX基因家族是具有homeobox结构域的典型家族，该结构域由3个螺旋结构组成。Homeobox结构域位于HOX基因的C末端，homeobox结构域的螺旋3可以嵌在特异结合DNA的大沟里，发挥转录因子的活性。HOXA1在小鼠和人类中都有了相关研究：Osamu等发现HOXA1突变纯合子的小鼠在出生或出生后不久即死亡，且小鼠的外耳和中耳中均存在缺陷，后脑的特定核心区及中枢神经也表现异常。Gavalas等发现HOXA1/HOXB1双突变可导致小鼠的外耳消失。HOXA1小鼠突变体的表型与人类的BSAS综合症和ABDS综合症的表型有相似的地方。BSAS患者的小耳畸形的伴随率为20%左右，患者还表现有眼睛水平凝视障碍和智力发育迟缓等问题。

二、制备方法

     以二花脸公猪和沙子岭母猪为祖代个体，构建近交群体。HOXA1基因突变筛查：由于HOXA1基因编码区的c.451G>TC突变导致。

二花脸×沙子岭F₂近交群体：此群体由1头二花脸公猪和1头沙子岭母猪杂交，选取全同胞的1头F₁公猪和1头F₁母猪，互交六胎次，生产F₂个体。

三、评价与验证

二花脸×沙子岭F₂近交群体，患病个体为双侧外耳缺失伴发外耳道闭锁，颞部CT显示为双侧外耳道闭锁、中耳结构发育不良；进一步的基因检测为HOXA1纯合突变。HOXA1基因纯合突变的猪动物模型，复合人类双侧小耳畸形畸形特征，为其进一步在小耳畸形病理机制中的应用提供基础。

动物模型查体

与正常个体相比，患病个体表现为：外耳明显变小甚至完全缺失，见于双侧耳；外耳道完全闭锁、少数仅仅存留一个瘘管样结构；身材矮小；呼吸急促；几乎不主动吃奶，人工喂养时也不能正常进食；呆滞；平衡感差；出生后两周内死亡。

为了进一步了解患病仔猪的各器官组织的发育情况，我们选择了3头患病个体进行解剖观察。结果显示患病个体的各器官组织无明显发育异常。沿着外耳道闭锁的小孔剪开患病个体的面部表皮和肌肉组织后，可见外耳道缺失；呈现为瘘管样小孔向里延伸形成发育不良的狭窄外耳道，底部闭锁未见鼓膜。

2. CT检测

为了明确患病个体的中耳及内耳情况，我们选择了1头正常个体和它的1头全同胞双侧耳朵缺失的患病个体，进行128层螺旋CT（Definition AS128，西门子，德国）头部扫描。扫描结果显示：患病个体双侧外耳道闭锁消失。中耳发育畸形。内耳未见明显异常。

3. HOXA1基因突变检测

突变位于HOXA1基因CDS区的第451个碱基处，由G突变为TC，即c.451G>TC，患病个体和两头F₀个体的sanger测序峰图如图所示。ORF分析表明此缺失插入突变造成了HOXA1蛋白翻译移框，导致第151位的丙氨酸A突变为亮氨酸L，从第151位氨基酸开始往后的所有氨基酸序列都发生改变，还形成了一个新的终止密码子TAA，使HOXA1蛋白的翻译提前终止，编码的氨基酸由336个减少为177个。功能分析表明突变蛋白缺少了HOX基因家族唯一的功能结构域homeobox。

四、鉴定和评价的其他材料

双侧外耳缺失伴发外耳道闭锁的猪动物模型鉴定及其在整形外科的应用.中华整形外科杂志， 2018,34(3):232-236.

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