Prkra 小耳小鼠动物模型

一、研究背景

小耳畸形的病因目前还不完全明确，环境和遗传因素是目前小耳畸形病因研究的重点。先天性小耳畸形在基因突变致病性研究方面还没有阐明小耳畸形胚胎发育的机制。小耳畸形主要涉及胚胎发育期间第一和第二鳃弓的异常，主要表型涉及外耳发育异常。外耳的耳廓是由第一和第二鳃弓的逐渐融合形成的，在发育过程中第一和第二鳃弓之间是相互作用，两弓之间的凹槽加深，形成外耳道，从胚胎的起源来分析，外耳的发育至少在一定程度上是由第一和第二鳃弓通过后脑的部分区域来介导的，后脑是鳃弓的神经嵴细胞的来源，在后脑的第四段基因突变可以导致外耳的发育缺陷。

小耳畸形主要是指外耳的先天发育性结构异常，其严重程度主要表现为从轻度结构异常到完全性耳廓缺失，并且可伴有外耳道狭窄和外耳道闭锁等一系列先天性外耳异常，轻者耳廓略小于正常， 畸形严重者耳廓全部消失， 绝大多数患者仅遗留花生状或贝壳状的残耳组织。同时一些小耳畸形患者也常合并颅面部畸形，中耳及半侧颜面骨及软组织发育不良等。

Prkra 小耳小鼠属于自发性突变,纯合型小鼠在2 周龄时即可见耳廓较小,身长尺寸比正常稍小。纯合型小鼠生长速度比杂合型或野生型同窝小鼠慢,成熟后不能生育,所以该品系主要靠杂合子与杂合子交配来繁育,获得实验所需的纯合型小鼠。Prkra 小耳小鼠突变位点为在2 号染色体76、643、218 bp(GRCm38)上的G向A 的突变转换,位于第3 外显子之后,这可能会影响前体pre-mRNA 的剪接。

二、制备方法

Prkra小耳小鼠(B6.Cg-Prkralear) 

1. Prkra小耳小鼠繁殖

小鼠饲养条件是按照普通常规鼠笼饲养,每个笼不超过5 只小鼠。繁殖方式:用同窝的1 只雄性和1 只雌性交配获得杂合小鼠,饲养到可以生育的成年鼠后,然后杂合与杂合再交配,得到没有表型的杂合雌、雄小鼠。

2. Prkra 小耳小鼠的基因点突变检测

DNA 测序:设计引物进行Sanger 法测序,应用试剂盒法裂解鼠尾提取DNA,洗脱出的DNA 于-20 ℃ 保存。通过引物3 在线平台( http:/ /primer3.ut.ee/ )设计候选变异引物,Prkra 正向引物为TTCAGTAGCGAGCCAGCAC,反向引物为ACAAC

TGTCCGCTCTGTCG。

聚合酶链式反应(PCR)反应体系:金牌Mix(green)27 μl,正向引物1 μl,反向引物1 μl,模板DNA 1 μl。

三、评价与验证

1. Prkra 小耳小鼠外耳表型

   通过饲养繁育得到5 只有表型的纯合型Prkra小耳小鼠,其耳廓结构都非常短小,发育明显较其正常同胞耳廓小, 失去正常小鼠耳廓亚结构形态,其耳廓形态与人先天性小耳畸形比较类似,外耳道也比正常同胞窄小,小鼠外耳发育的差异在2 周龄时就很明显。

2. Prkra 小耳小鼠骨骼阿利新蓝染色

    选取发育到40 d 的小耳小鼠和正常小鼠,剥皮处理,放入75%乙醇固定2 周,然后放入阿利新蓝工作液中进行软骨染色2 d(根据样品大小调整染色时间),再放入茜素红工作液中染色1 d,放入1. 5%双氧水溶液中进行漂白(肉眼可见色素去除为标准),脱色后依次放入20%、40%、60%、80%的甘油进行梯度透明各2 周,最后放入100%纯甘油中进行保存。

Prkra 小耳纯合型突变小鼠骨骼发育受到明显影响,体型较正常野生型小,四肢骨发育基本正常,但较细短,后肢表现尤为明显。Prkra 小耳小鼠胸廓、肋骨数目基本正常,畸形小鼠肋骨发育较细小,尾骨发育较细短,头颅发育略小。

四、鉴定和评价的其他材料

刘伟，林琳，杨庆华，潘博，何乐人，蒋海越.Prkra小耳小鼠动物模型在先天性小耳畸形研究中的应用[J].中华整形外科杂志，2019,35（8）:804-808.

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