Tbx6基因敲除骨骼畸形小鼠模型

一、研究背景

一、疾病概述

先天性脊柱侧凸（Congenital Scoliosis，CS）指由胚胎期脊柱骨性椎体发育异常引起的脊柱畸形，临床定义为由椎体结构异常导致的脊柱侧方弯曲超过10度。脊柱发育的畸形异常源于母孕期4~6周椎体发育时期，目前认为是一种高频罕见病，其发病率在活产婴儿约为1/1000。CS可单独存在或与一些先天异常导致的器官综合症伴发。CS具有进展快、畸形重、并发症多等特点，严重时可致患者瘫痪，是造成青少年残疾的主要疾病之一，给患者和家庭造成了严重负担。目前临床治疗CS以支具缓解或手术治疗为主，缺乏病因学治疗手段。

先天性脊柱侧凸可按照其畸形类型被分为分节不良型、椎体形成不良型及混合型，其中，单纯分节不良或椎体形成不良者约占80%，混合型约占20%。分节不良主要由于上下节段间骨性融合引起，可具有双侧融合（骨块）、单侧融合（骨桥）等特征。椎体形成不良会产生异形椎体，如楔形椎、半椎体、蝴蝶椎等。

CS的致病机制目前尚未完全阐明，国内外已发表的研究工作集中在脊柱发育生物学和人类遗传学的探索。从发育生物学角度，脊椎动物脊柱的发育主要包括体节形成（somitogenesis）和成骨（osteogenesis）两个关键过程。目前已解释的CS致病突变集中在影响体节分节和成骨成软骨过程的基因及相关信号通路，其致病分子机制和临床干预手段尚待进一步阐明。

北京协和医院及复旦大学团队前期研究提示，罕见的TBX6基因突变联合常见TBX6亚效等位基因可导致以胸腰段半椎体为特征性临床表型的先天性脊柱畸形，称TBX6相关先天性脊柱侧凸（TBX6-associated congenital scoliosis，TACS）。该遗传分子诊断分型约可以解释约10%的汉族人群CS遗传学病因。TBX6是调控胚胎期中轴骨形成的重要节律基因，前期研究已解释部分参与脊柱分节的分子机制，且在CS发病人群中的单核苷酸多态性存在变化。TBX6参与CS发生发展过程的具体分子机制尚待进一步解释。

二、模型背景

1、小鼠信息

FVB/NJ小鼠品系源自远交系Swiss鼠。1935 年，在美国国立卫生研究所NIH 饲养，1966 年起开始选育，在接种白日咳疫苗后，其中一系HSFS/N对组胺(Histamine)敏感。70 年代初，在HSFS/N系第八代发现部份小鼠携带Fv1 b 基因对B strain Friend 白血病毒敏感，后育成Fv1b同型合子近交系，称FVB。NIH 、Jackson等保存。

FVB 通用于基因转殖实验，有强的繁殖力，产生一窝仔数多，受精卵有大而显著的前核，易于显微注射DNA ，注射后活力强如C57BL/6 × SJL F1 杂交鼠，远胜于C57BL/6 (Taketo et al., 1991)。

2、实验动物背景信息

该动物模型在FVB/NJ品系的基础上，参照人类CS队列遗传学信息，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建相应的Tbx6无效突变等位基因和promotor区域突变的亚效等位基因。

3、研究背景

此前研究表明，TBX6无效突变联合亚效等位基因可解释约10%汉族人群先天性脊柱侧弯的遗传学发病机制。基于此，研究团队设计了Tbx6基因敲除小鼠，试图在动物模型上再现TACS的表型。

二、制备方法

此前研究表明，TBX6无效突变联合亚效等位基因可解释约10%汉族人群先天性脊柱侧弯的遗传学发病机制。基于此，研究团队设计了Tbx6基因敲除小鼠，试图在动物模型上再现TACS的表型。
      采用CRISPR/Cas9技术，在FVB/NJ小鼠上进行基因编辑。首先，在exon2上加入1bp的碱基插入，造成重要T-box区域的移码突变，该移码突变将严重影响Tbx6基因的正常功能，模仿人类遗传学发现的无效突变。研究证实Tbx6纯合突变的小鼠胚胎期致死，这与先前的研究一致。随后，参考人类的亚效等位基因，我们在Tbx6基因的promotor区域进行基因编辑，获得了Tbx6亚效等位基因（Tbx6 mh），并在luciferase实验中证实其基因功能约为野生型Tbx6基因的70%。Tbx6mh/mh 和Tbx6+/-交配即获得TACS小鼠。

三、评价与验证

  1. Tbx6亚效等位基因的建立。

Tbx6基因调控区域的8个碱基敲除获得mh等位基因（A），luciferase显示亚效等位基因的转录活性（C），in situ显示Tbx6 mh纯合小鼠尾端的Tbx6表达下降（D）。Yang et al., Hum Mol Genet. 2019 Feb 15;28(4):539-547.

2. TACS小鼠的表型评估。

胚胎期E14.5野生型和TACS小鼠的阿尔新兰染色结果，提示椎体和肋骨的异常（AB）。

3. TACS小鼠microCT

成年小鼠的背面和腹侧观，可见半椎体及脊柱侧弯的表型，以及部分肋骨融合（AB）。

4. 动物模型的评价与验证

涉及Tbx6基因敲除小鼠的动物模型实验包括新生小鼠及鼠胚胎的基因型验证、骨骼染色、骨骼组织的石蜡及冰冻切片染色、microCT扫描等等。评价指标包括脊柱及肋骨的畸形状态、胚胎骨骼发育情况等等。

1.  小鼠基因型鉴定

l  取新生小鼠（P0到P10）鼠耳耳标组织，置于EP管中，加入75ul碱性裂解液并金属浴95摄氏度加热15min；

l  冰上冷却1min，加入75ul中和液获得DNA原液；

l  按照MasterMix配方制备PCR体系，进行PCR；

l  跑胶，切胶回收目的条带，提纯sanger测序。

2.  骨骼染色

l  二氧化碳法处死小鼠，剥离全部皮肤及内脏，小心去除脂肪组织；

l  置于95%乙醇溶液室温过夜；

l  乙醇更换为100%乙酮室温过夜，去除多余的脂肪组织，在关节处用针头戳若干小孔；

l  更换100%乙酮为阿尔欣兰染液（0.03% in 80% ethanol and 20% glacial acid），根据样本周龄室温浸染1-3天；

l  更换染液为0.05%茜素红染液（1%KOH），根据样本周龄室温浸染1-3天；

l  KOH脱色透明化1-3天，待软组织透明化后梯度更换为Glycerol KOH溶液。

3.  骨骼组织石蜡切片

l  骨骼组织分离，4%PFA于4摄氏度固定过夜

l  PBS洗三遍，进行EtOH脱钙15天

l  上自动脱水机进行脱水与石蜡预浸润

l  石蜡包埋，切片

4.  骨骼组织冰冻切片

l  骨骼组织分离，4%PFA于4摄氏度固定过夜

l  PBS洗三遍，进行EtOH脱钙15天

l  30%蔗糖溶液脱水，optium预浸润

l  冰冻包埋，切片

四、生物安全性

该基因编辑小鼠将在屏障隔离环境（北京协和医院实验动物中心）内进行繁育、饲养及相关实验，其监督管理措施由动物中心负责。屏障隔离期间将保持清洁，保证其具有SPF级别清洁度，减少感染及发病几率。严格实验室管理，防止小鼠外泄，实验设计时将禁止其与野生型小鼠交配，保证编辑基因组序列不向自然界流通。上述措施将保证该动物模型的生物安全性，避免其影响生态环境。

五、讨论和结论

该模型采用了CRISPR/Cas9技术，创新性地结合了人类遗传学与动物基因编辑技术，首次在小鼠上重构了与人类疾病类似的遗传模式，在Tbx6基因上同时引入无效突变和promotor区域的亚效等位基因，并将二者结合，形成复合杂合突变并获得相应的脊柱畸形表型。该模型是国际上首创的复合杂合突变脊柱畸形表型，对于解释先天性脊柱侧凸的分子机制和发病过程具有极高的研究讨论价值。

六、鉴定和评价的其他材料

1: Yang N, Wu N, Zhang L, Wu Z, Lupski JR, Zhang F, et al. TBX6 compound inheritance leads to congenital vertebral malformations in humans and mice. Hum Mol Genet. 2019 Feb 15;28(4):539-547.

2: Ren X, Yang N, Wu N, Shi J, Zhang F, Liu P et al. Increased TBX6 gene dosages induce congenital cervical vertebral malformations in humans and mice. J Med Genet. 2020 Jun;57(6):371-379.

3: Liu J, Wu N, Yang N, Lupski JR, Zhang F, Qiu G, et al. TBX6-associated congenital scoliosis (TACS) as a clinically distinguishable subtype of congenital scoliosis: further evidence supporting the compound inheritance and TBX6 gene dosage model. Genet Med. 2019 Jul;21(7):1548-1558.

4: Yang N, Wu N, Dong S, Wu Z, Lupski JR, Zhang F, et al. Human and mouse studies establish TBX6 in Mendelian CAKUT and as a potential driver of kidney defects associated with the 16p11.2 microdeletion syndrome. Kidney Int. 2020 Oct;98(4):1020-1030.

5 Wu N, Ming X, Xiao J, Lupski JR, Qiu G, Zhang F, et al. TBX6 null variants and a common hypomorphic allele in congenital scoliosis. N Engl J Med. 2015 Jan 22;372(4):341-50. 

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