TBX6相关先天性脊柱侧凸小鼠模型

一、研究背景

先天性脊柱侧凸即通过X线，MRI或手术证实的特定的先天性椎体异常而引起的脊柱侧凸。这种畸形出生后即发病，因而患者出现畸形较特发性脊柱侧凸早。早期发病使先天性脊柱侧凸患者很少能接受到早期最佳的治疗。由于形成的弯曲易于进展，并且患者仍有较长的生长期，所以容易产生较严重的畸形。先天性脊柱侧凸通常较僵硬，难于矫正。根据畸形的类型对脊柱侧凸进行分型，主要分为形成障碍，分节不良和混合畸形。形成障碍最典型的例子即半椎体；典型的分节不良为骨桥，即两个或多个椎体一侧或双侧的骨性连接；混合型即同一患者同时具有以上2种畸形。

二、制备方法

FVB/NJ品系基因敲除小鼠。

采用CRISPR-Cas9技术编辑小鼠基因组。我们混合了向导RNA和Cas9 mRNA（每个RNA 10 ng /μl），注射到FVB / NJ品系小鼠的合子（每次注射编辑200个细胞）。取得F0小鼠后，与野生型FVB / NJ小鼠杂交以获得后代。我们使用来自脚趾的基因组DNA，通过PCR和Sanger测序对小鼠进行基因分型。

三、评价与验证

1. 剂量依赖性的先天性椎体畸形复合遗传模型

使用小鼠胚胎的体内测定，我们展示了剂量依赖性的先天性椎体畸形复合遗传模型。该模型由Tbx6无效等位基因 (‒) 和亚等位基因（mh）组成。(A) 阿尔新蓝染色的E14.5小鼠胚胎的背面视图。显示了一个没有明显椎体畸形的胚胎。(B) 显示了一个具有椎体畸形的胚胎。红点和箭头分别表示椎体畸形和肋骨融合。比例尺为1mm。 (C) 在Tbx6 + / +，Tbx6 + / mh，Tbx6 mh / mh或Tbx6 + / ‒ 的E14.5小鼠胚胎中未观察到明显的椎体畸形，而Tbx6 mh / ‒ 胚胎表现出高穿透率的椎体畸形。样本量显示在下面的列中。****，P ＜0.0001。

2. 成年小鼠的Micro-CT结果

成年小鼠的Micro-CT结果。(A) 通过Micro-CT扫描显示成年小鼠的背侧和腹侧图像，未见明显椎体畸形。(B) 通过Micro-CT扫描显示一只具有椎体畸形的小鼠。 白色箭头和箭头分别指示椎体畸形和肋骨融合。(C) Tbx6 + / +，Tbx6 + / mh，Tbx6 mh / mh，Tbx6 + / + 和Tbx6 mh / ‒ 基因型的成年小鼠Micro-CT图像。 样本量显示在每列下方。 ****，P ＜0.0001。

四、鉴定和评价的其他材料

Yang N, Wu N, Zhang L, et al. TBX6 compound inheritance leads to congenital vertebral malformations in humans and mice. Hum Mol Genet. 2019;28(4):539–547.

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