人胃癌细胞株23132/87皮下移植小鼠模型

一、研究背景

胃癌 （Gastric cancer, GC）是来源于胃黏膜上皮细胞的恶性肿瘤。主要包括胃腺癌、胃肠道质瘤、胃肠道平滑肌肉瘤、胃肠类癌、胃肠道淋巴瘤，其中胃腺癌最为常见，占90%以上。胃癌是我国及全球发病率最高的恶性肿瘤之一。围手术期治疗，包括化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗等手段，可以减少全身肿瘤负荷，降低肿瘤分期，从而增加肿瘤根治性切除的可能性。目前临床上以放化疗等传统治疗手段为主但疗效有限. 近年来, 靶向治疗与免疫治疗等新型治疗手段取得了突破性进展, 目前有2类靶向药物 (anti-HER2, anti-VEGFR) 及免疫检查点抑制剂（anti-PD-1）在胃癌中批准[1]，但远不能满足临床的需求。

1. 病因与发病机制

胃癌病因和发病机制是多因素的，主要危险因素包括幽门螺杆菌感染、环境因素、饮食因素、遗传因素、癌前状态等。幽门螺杆菌是世界上最常见的细菌感染之一。它会引起十二指肠和胃溃疡以及慢性胃炎。幽门螺杆菌感染显著增加胃腺癌的风险。世界卫生组织(World Health Organization, WHO)将幽门螺旋杆菌归类为I类致癌物。细菌生活在胃的粘膜内层，可引起慢性炎症（胃炎）。这种炎症可导致促进癌症发展的DNA损伤。幽门螺杆菌与70%以上的胃腺癌有关。胃癌患病风险增加与高盐和各种盐腌制食品等摄入过多以及蔬菜、水果、奶类和维生素 A 摄入较少有关。约有 10% 的胃癌病例出现家族聚集性，称为遗传性弥漫性胃癌，由CDH1基因突变引起。此外，癌前疾病包括慢性萎缩性胃炎、胃息肉、胃溃疡、术后残胃等与胃癌的发生也密切相关。

2. 流行病学

在近30年来胃癌的发病率和死亡率呈下降趋势。2020年GLOBOCAN全球癌症统计数据表明，胃癌发病率居全球恶性肿瘤第5位，死亡率居第4位。男性胃癌发病率是女性的2倍。东亚、东欧及南美地区胃癌发病率较高，北美及北欧地区胃癌发生率较低[2]。我国是胃癌大国，发病率和死亡率均高居恶性肿瘤第3位。由于胃癌的早期症状不典型、筛查体系不完善，我国约60%以上胃癌患者确诊时已为局部晚期或进展期，5年生存率不足30%。因此，我国胃癌现状可以用基数大、分期晚、预后差进行概括。

3. 临床表现

早期胃癌患者常无特异的症状，随着病情的进展可出现类似胃炎、溃疡病的症状，主要有：1）上腹饱胀不适或隐痛，以饭后为重；2）食欲减退、嗳气、返酸、恶心、呕吐、黑便等。进展期胃癌除上述症状外，常出现：体重减轻、贫血、乏力。3）胃部疼痛，如疼痛持续加重且向腰背放射，则提示可能存在胰腺和腹腔神经丛受侵。胃癌一旦穿孔，可出现剧烈腹痛的胃穿孔症状。4）恶心、呕吐，常为肿瘤引起梗阻或胃功能紊乱所致。贲门部癌可出现进行性加重的吞咽困难及反流症状，胃窦部癌引起幽门梗阻时可呕吐宿食。5）出血和黑便，肿瘤侵犯血管，可引起消化道出血。小量出血时仅有大便潜血阳性，当出血量较大时可表现为呕血及黑便。6）其他症状如腹泻(患者因胃酸缺乏、胃排空加快)、转移灶的症状等。晚期患者可出现严重消瘦、贫血、水肿、发热、黄疸和恶病质。

4. 临床分期

最常用来对胃癌进行分期的系统是美国癌症联合委员会（AJCC）的TNM分期系统。其中T代表肿瘤（Tumor），包括原发肿瘤在哪里，扩散到胃壁和临近器官有多深；N代表淋巴结（Lymph node），包括肿瘤是否扩散到淋巴结，如果有的话，扩散到了哪里的淋巴结和影响到了多少淋巴结；M代表转移（Metastasis），包括癌症是否转移到到身体其他部位，最常见的胃癌远端转移部位包括肝脏、腹膜和远处淋巴结。

5. 胃癌分型

5.1组织分型

胃癌的组织学分型是以肿瘤的组织结构、细胞形态和分化程度为依据, 目前常用的病理形态学分类主要是Lauren分型和WHO分型。

Lauren分型是1965年由北欧病理学家Lauren提出, 将胃癌分为肠型、弥漫型以及混合型和未确定型[3]。肠型胃癌在胃癌高发区常见, 一般发病年龄较晚, 男性多见, 多发生在胃窦; 而弥漫型胃癌在低发区多见, 多见于青年女性, 胃体多发, 有遗传倾向性, 容易出现腹膜播散种植转移，预后更差。

WHO消化系肿瘤分类将胃癌分为5个主要分型和其他少见类型, 主要分型均为腺癌, 约占胃癌的95%, 起源于胃黏膜层的腺上皮, 包括乳头状腺癌、管状腺癌、黏液腺癌、差黏附性癌(包括印戒细胞癌及其变异型)及混合型腺癌; 其他少见类型癌, 约占5%, 包括腺鳞癌、伴淋巴样间质癌(髓样癌)、肝样腺癌、鳞状细胞癌、绒毛膜癌与癌肉瘤、壁细胞癌、横纹肌样肿瘤、黏液表皮样癌、潘氏细胞癌、未分化癌、腺神经内分泌癌、内胚窦肿瘤、胚胎样癌、卵黄囊肿瘤及嗜酸细胞腺癌。但WHO分类不能反映细胞分化程度, 因此, 病理诊断中常结合分化程度进一步分型为高分化(1级)、中分化(2级)和低分化型(3级)。

5.2 分子分型

随着基因组学、转录组学、代谢组学以及表观遗传等研究的开展, 胃癌的分型逐渐从传统的组织病理学分型过渡到分子分型.尤其是从2013到2015年, 杜克-新加坡国立大学(2013)[4], 癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA, 2014)[5]以及亚洲癌症研究组(Asian Cancer Research Group, ACRG, 2015)[6]这三个研究中心通过结合新一代的测序技术相继发表了一系列的大样本胃癌分子分型研究数据. 这些分型之间既有重叠又有各自独立的特点,对临床预后有重要的指导意义，并且揭示了多个潜在的针对不同分型的靶向治疗策略. 以ACRG分型为例, 提出了4个胃癌分子亚型:微卫星不稳定（MSI）型、微卫星稳定（microsatellite stability，MSS）/上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）型, MSS/p53+型、MSS/p53-型。其中MSS/EMT型，多对应Lauren弥漫型，较其它亚型发病年龄显著偏低，分期较晚（Ⅲ或Ⅳ期），4种亚型中预后最差, 复发率高到63%。该亚型基因突变频率低，常见钙黏蛋白E-cadherin/CDH1表达下调。

二、制备方法

人胃癌细胞株23132/87：源于一名72岁男性胃腺癌患者的原发肿瘤体外培养构建而成。细胞呈上皮样细胞单层贴壁生长。细胞培养在37度恒温培养箱，CO2浓度为5%，培养基为RPMI1640+10% 胎牛血清。细胞倍增时间约为50h。

荧光素酶表达载体: 

载体类型：慢病毒基因表达载体

荧光标签: Firefly Luciferase

真核细胞筛选抗性：Puromycin

原核抗性：Ampicillin

BALB/c nude小鼠：全身无毛，发育迟缓，抵抗力低下，母性差，易发生严重感染；胸腺缺失，为第11对染色体隐性遗传；T细胞免疫缺陷，B细胞正常，具有较高的NK细胞活力；无接触敏感性，无移植排斥反应。

        试剂：异氟烷

        器械及仪器：异氟烷汽化器、1ml注射器、游标卡尺、弯头解剖镊、16cm直头组织剪、医用胶布、聚苯乙烯泡沫塑料垫、体重秤、小动物活体成像仪。

        实验环境 

细胞实验在细胞培养实验室生物安全柜中操作，动物手术在SPF动物实验室生物安全柜中操作。

        实验操作规程

       首先构建荧光素酶稳定表达23132/87细胞，皮下接种小鼠，后续在不同时间点利用荧光活体成像并结合肿瘤体积测定检测肿瘤模型是否构建成功。具体操作如下：

1） 构建荧光素酶稳定表达23132/87细胞。

     荧光素酶表达载体Ubc.Luc.IRES.Puro（addgene#33307）与第三代慢病毒包装质粒pMDLg/pRRE （addgene #12251）, pRSV-Rev（addgene #12253）, pCMV VSV-G（addgene #12259）共转染HEK293T 细胞后，分别在48h和72h收集病毒上清，0.45µM过滤器过滤后感染目的细胞。通常，细胞以5x10⁵个细胞/孔铺到6孔板中后加入3-4ml含有病毒的培养基和5mg/mL polybrene(碧云天#C0351)，水平离心机离心感染（1800g, 25℃，1h)，37℃下孵育24h后换液。病毒感染后72h 添加1mg/mL Puromycin处理1周左右筛选出稳定表达荧光素酶的细胞。

2） 动物自由活动，采用耳号标记；左手抓取固定小鼠，右手持注射器于小鼠右侧腋下注射5×10⁶个/150µl胃癌细胞。

3） 在不同时间点利用小动物活体成像仪进行荧光活体成像以及游标卡尺测定肿瘤体积检测肿瘤成瘤及生长情况。 

4） 在不同时间点测定小鼠体重 并观察小鼠活动和饮食状况。

三、评价与验证

1. 人胃癌23132/87荧光素酶标记细胞的鉴定      

23132/87感染荧光素酶慢病毒后72h 添加Puromycin处理1周左右筛选稳定表达细胞，取1x106细胞/孔铺到6孔板，添加荧光素底物后室温孵育5min，利用小动物活体成像仪检测荧光水平。

2. 小鼠肿瘤体积和体重。

不同时间点检测小鼠肿瘤体积和体重。(A)小鼠肿瘤体积呈明显增长趋势（n=6）。(B)小鼠体重（n=6）。小鼠体重有轻度下降，但活动和进食无明显变化。

3. 小鼠活体荧光成像检测肿瘤生长情况。

不同时间点对小鼠进行活体荧光成像，荧光信号呈明显增强趋势。(A)不同时间点荧光成像结果。(B)荧光强度均值（n=6）。

评价方法：

      1）细胞荧光素酶活性鉴定。

      该模型利用荧光素酶慢病毒表达系统实现在肿瘤细胞中稳定高效地表达荧光素酶。

2) 肿瘤成瘤及生长情况。

       该模型利用小动物活体成像仪进行荧光活体成像以及游标卡尺测定肿瘤体积检测肿瘤成瘤及生长情况。两种方法均显示肿瘤成功接种并随时间呈明显增长趋势。

评价指标：

主要指标：

1）细胞稳定表达高水平荧光素酶活性。

2）荧光活体成像呈阳性并随时间呈增长趋势。

3）肿瘤体积呈增长趋势。

重要指标：小鼠活动、进食及体重变化。

四、生物安全性

本模型制作不涉及微生物。

实验中涉及到人胃癌细胞系的细胞均使用从公司购买的商品化人源胃癌细胞系，由实验室工作人员统一严格管理。实验操作严格遵守P2实验室个人防护及操作规范，相关实验在生物安全柜中进行，将剩余细胞、组织或者污染物置于废液桶内，作为医疗垃圾进行专门处理。

动物模型制备过程中遵循福利和各项管理度，并未传代，于SPF屏障环境下饲养，动物无逃逸。

模型制备完成后，在进行病理染色析对环境和生态并未产明显影响。

五、讨论和结论

1. 该模型技术方法和指标体系主要包括三个方面：
1) 细胞水平：构建稳定表达高水平荧光素酶活性的肿瘤细胞株。
2) 组织水平：肿瘤体积测定检测肿瘤成瘤及生长情况。
3) 动物水平：荧光活体成像检测肿瘤成瘤及生长情况。
2. 皮下移植瘤模型建模简便易行、可重复性高，国内外建模方法基本相同。

3. 目前仅有两篇早期文献报道分别通过直接皮下或原位接种23132/87至裸鼠构建肿瘤模型，我们通过构建荧光素酶标记23132/87细胞并皮下接种裸鼠，能够同时通过荧光活体成像结合肿瘤体积测定检测肿瘤模型是否构建成功，其中荧光活体成像特异性强、灵敏度高、定位准确，但对检测设备要求高。该模型将用于研究肿瘤发病机理和临床前评估药物体内药效。

六、鉴定和评定的其他材料

参考文献：

1. Liu, X. and S.J. Meltzer, Gastric Cancer in the Era of Precision Medicine. Cell Mol Gastroenterol Hepatol, 2017. 3(3): p. 348-358.

2. Sung, H., et al., Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin, 2021. 71(3): p. 209-249.

3. Lauren, P., The Two Histological Main Types of Gastric Carcinoma: Diffuse and So-Called Intestinal-Type Carcinoma. An Attempt at a Histo-Clinical Classification. Acta Pathol Microbiol Scand, 1965. 64: p. 31-49.

4. Lei, Z., et al., Identification of molecular subtypes of gastric cancer with different responses to PI3-kinase inhibitors and 5-fluorouracil. Gastroenterology, 2013. 145(3): p. 554-65.

5. Cancer Genome Atlas Research, N., Comprehensive molecular characterization of gastric adenocarcinoma. Nature, 2014. 513(7517): p. 202-9.

6. Cristescu, R., et al., Molecular analysis of gastric cancer identifies subtypes associated with distinct clinical outcomes. Nat Med, 2015. 21(5): p. 449-56.

7. Illert, B., et al., Optimization of a metastasizing human gastric cancer model in nude mice. Microsurgery, 2003. 23(5): p. 508-12.

8. Otto, C., et al., Growth of human gastric cancer cells in nude mice is delayed by a ketogenic diet supplemented with omega-3 fatty acids and medium-chain triglycerides. BMC Cancer, 2008. 8: p. 122.

9. Xiao, J., et al., Global liver disease burdens and research trends: Analysis from a Chinese perspective. J Hepatol, 2019. 71(1): p. 212-221.

10. Bray, F., et al., Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin, 2018. 68(6): p. 394-424.

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