非酒精性脂肪性肝病斑马鱼模型

  中文名称:   非酒精性脂肪性肝病斑马鱼模型       英文名称: NA
  类型:   非酒精性脂肪性肝病动物模型                  分级: NA
  研制单位:   中国医学科学院医药生物技术研究所 保存单位: 中国医学科学院医药生物技术研究所
  主要用途:   用于非酒精性脂肪性肝病（Non-Alcoholic Fatty Liver Disease, NAFLD）研究。
是否通过鉴定与评价:   否
一、研究背景
一、疾病名称 
       非酒精性脂肪性肝病（Non-Alcoholic Fatty Liver Disease, NAFLD）
 二、临床发病机制及症状  
       非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)被认为是仅次于酒精和病毒性肝炎导致肝硬 化的第三大病因。NAFLD 是指除外酒精和其他明确的肝损伤因素所致的，以弥 漫性肝细胞大泡性脂肪为主要特征的临床病理综合征，包括单纯性脂肪性肝病以 及由其演变的脂肪性肝炎和肝硬化。肥胖、II 型糖尿病、高脂血症等单独或共同 成为 NAFLD 的诱因。NAFLD 多伴有中心性肥胖、胰岛素抵抗和脂质代谢紊乱，也被认为是代谢综合征的一种表现。病理特征：以大泡性或以大泡性为主的肝细胞 脂肪变性为特征。 
三、模式动物 
       斑马鱼(Zebrafish, Danio rerio) AB 或 TU 野生型品系均可。
二、制备方法
1. 实验动物 
     野生型斑马鱼 AB 品系。 
2. 造模化合物及斑马鱼处理 
     采用高脂、高糖、高胆固醇三种饮食方案饲喂斑马鱼幼体。具体方案见图1 （Ref.1）。主要步骤：取野生型斑马鱼幼体(5 dpf)，随机分为4组：正常饮食(30 mg/d AP100)、高胆固醇(30 mg/d AP100 plus 4% (w/w) cholesterol)、高糖(30 mg/d AP100 plus 0.25%(w/v) fructose)、高脂(180 mg/d AP100)，按照gezi 饮食方案饲 喂10天。饲喂终止后，空腹过夜，收集幼体进行后续实验检测。为了观察胆固醇 在体内的分布，在4组食物中添加BODIPY 标记的胆固醇(10μg/g cholesteryl BODIPY 542/563-C11, Invitrogen)。 
3. 模型分析指标 
（1） 症状观察 2 观察和拍照斑马鱼表型；测量斑马鱼幼体体长和称重，统计学处理并比较 4 组数据。 
（2） 病理检测 A. 对斑马鱼整体进行油红染色，检测体内脂质蓄积水平和分布；荧光显微镜 下观察 BODIPY 标记的胆固醇在体内的分布和强度。B. 肝脏冰冻切片和油红 O 染 色；C. 肝脏石蜡切片和 H.E 染色。 
（3） 病理诊断 采用肝脏组织切片和 HE 染色检测，以脂质/胆固醇在肝脏蓄积、或以大泡性 为主的肝细胞脂肪变性为特征。 
三、评价与验证
 1. 动物症状观察 高胆固醇、高糖、高脂饮食的三组幼体体长均比 WT 组幼体体长增长。但高胆 固醇、高脂饮食导致斑马鱼体重增加、肝区扩大，高脂组的幼体腹部和头部的透 明度明显降低。高糖组体重未见变化，但头部和内脏区透明度也明显下降。 
 高胆固醇、高糖或高脂饮食对斑马鱼幼体生长的影响 (A) 四组不同饲喂方案；(B) 四组饮食饲喂终点时的幼体表型；(C) 幼体在15 dpf 的平均体 3 长 (n = 20).；和平均体重(n = 10，每组从100条中随机取10条幼体称重）。a, 与对照组比较; b, 与EF组比较; c, 与HF组比较; *P < 0.05, #P < 0.01; Bar = 1 mm. 2. 病理改变 体内总胆固醇和总脂升高，显微镜下可见肝脏有明显脂质蓄积和脂肪泡，肝 结构改变。
生化指标检测显示：过量饮食组的总脂质/甘油三酯、胆固醇 和葡萄糖均明显高于对照组。胆固醇组的总脂质/胆固醇明显高于对照组，甘油三 酯略高，葡萄糖低于对照组。高糖组的总脂质、甘油 三酯和葡萄糖均高于对照组， 而胆固醇水平与对照相当。
脂质在斑马鱼幼体体内的蓄积 A. 油红染色示不同饮食组的幼体肝区脂质水平；B. 示四组幼体肝区胆固醇的蓄积平； C. 示四组幼体躯干血管的胆固醇水平； D. 肝脏冰冻切片和油红 O 染色显示脂质在肝区的 蓄积和脂肪变性；E. 肝脏石蜡切片和 H.E 染色显示肝小叶排列变化和肝细胞内脂肪泡情况； F. 油红染色阳性区半定量统计比较；G. 胆固醇与每毫克蛋白之比；H. 甘油三酯与每毫克蛋 白之比；I. 糖与每毫克蛋白之比。F-I 数据来自斑马鱼肝脏。*P < 0.05 vs. Control. Bar =100 μm。

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