耳功能损伤斑马鱼模型

一、研究背景

一、疾病名称 

        听力损伤 (Hearing impairment)

 二、临床发病机制及症状 

        耳功能损伤临床症状主要有眩晕、平衡失调和耳鸣、耳聋。耳是人和脊椎动 物的听觉和平衡器官。内耳和毛细胞是执行这两功能主要器官和细胞。人的内耳 包括前庭、半规管和耳蜗三部分。前庭和半规管是位觉感受器，负责感受体位和 调节身体平衡；而耳蜗是听觉感受器，与听力相关；以及在它的外壁的两个耳斑： 卵圆窗和圆窗。位觉感受器受损的表现为眩晕、恶心、平衡失调和步态不稳。听 觉感受器受损的表现为耳聋。其损害的直接靶位为内耳组织器官的毛细胞。 药物耳毒性是指药物导致的内耳损伤，这种损伤可以发生在耳蜗，前庭或/ 和听神经。药物耳毒性可以是可逆性的如阿司匹林等，也可导致永久性耳聋如氨 基糖苷类和一些抗癌药如卡铂，顺铂等。有研究报道，我国约 100 万以上的聋哑 儿童中 2/3 是滥用耳毒性药物所致。大量的调查数据和研究报道证实，氨基糖甙 类抗生素药物的耳毒性致聋不仅位于国内药物致聋的首位，而且是导致新生儿先 天和后天性耳聋以及成人耳聋的各种致聋因素排位之首。 

三、模式动物 

        斑马鱼(Zebrafish, Danio rerio) AB 或 TU 野生型品系均可。

二、制备方法

1. 实验动物

       野生型斑马鱼 AB 或 TU 品系 5 dpf 幼体。斑马鱼的位听觉器官由相当于哺 乳动物内耳的耳囊及其附属结构构成，包括神经丘(有数个位于中心的毛细胞和 围绕在周围的支持细胞构成)、半规管和两个耳囊（椭圆囊和圆囊，相当于人的 卵圆窗和圆窗），其功能与人类内耳相同。另外，在斑马鱼侧线系统上的神经丘 毛细胞也具有位觉功能。斑马鱼 5-dpf 幼体直到成年，其对声音的刺激域和频宽 是不变的。因此，斑马鱼的位听觉器官是研究位听觉的理想模型。

 2. 造模化合物及其对斑马鱼的处理 

       造模药：氨基糖苷类药物：庆大霉素(Gentamycin)、新霉素(Neomycin)和链 霉素(Streptomycin)。 三种造模药通过预实验确定给药浓度梯度。均使用人工海水直接配置。将发 育至 6 hpf 的斑马鱼胚胎暴露于上述三种氨基糖苷类药液中，直至 72 hpf。撤去 药液，用正常饲养液清洗斑马鱼后，继续发育至 5、6 dpf，进行后续处理。

 3. 模型分析指标 

（1） 症状观察 斑马鱼身体平衡失调和体位异常与其位觉功能损伤相关。正常斑马鱼的 5 dpf 幼体静止时体位为俯位。斑马鱼幼体在静止时呈斜侧位，或游动姿态异常，均为 体位失衡。 

（2） 毛细胞损伤检测 取野生型和造模药处理的斑马鱼幼体（6 dpf），分别浸入活体荧光染料 1 μM Yo-Pro-1（Invitrogen）的人工海水中避光孵化 1 小时，将斑马鱼用人工海水洗三 次，再将胚胎置于麻醉剂 MS222 (3-aminobenzoic acid ethylester, methanesulfonate salt, Sigma) 0.1mg/ml 中，麻醉后在荧光显微镜下观察毛细胞形态、数量和排列， 并拍摄、计数。 

（3） 病理诊断 显微镜下观察活体幼体耳结构的变化，包括半规管和耳囊形态结构的变化。 以同批野生型斑马鱼幼体为正常对照组，药物处理组撤药 2 天后，以耳石周 围的 MI1、MI2、O1、O2、IO4 五个部位的神经丘毛细胞作为主要观察对象，结 合侧线神经丘和毛细胞的观察、计数。以神经丘毛细胞数量减少和毛细胞结构异 常为病理诊断指标。 

（4）基因检测 RT-PCR 方法检测听觉发育基因的转录水平：收集野生型和药物不同浓度处 理胚胎各 40 枚, 用 Trizol 提取总 RNA; 以 AMV 反转酶反转录试剂盒(Promega 3 Co.) 合成 cDNA1st 模板；进行常规 PCR。以 β-actin 基因作为内参基因。PCR 产物电泳, 凝胶成像分析仪拍照记录。

三、评价与验证

1. 动物症状及病理观察 在药物处理、撤药 2 天后，以耳石周围的 MI1、MI2、O1、O2、IO4 五个部位 的神经丘毛细胞作为主要观察对象，发现这五个部位的神经丘毛细胞均有不同数 量的减少，同时侧线神经丘和毛细胞也有不同程度的减少；此外，处理 组幼体的半规管和耳石结构出现异常：卵圆囊变为圆形，而圆囊变小且不规则。另外，幼体的身体姿态静止时失衡，这些症状均与人的位听功能损 害表现相似。

咨询电话： 400-6988-095