中文名称: | CTLA4敲除小鼠模型 | 英文名称: | CTLA4 knockout mouse _model |
类型: | 免疫疾病模型 | 分级: | NA |
研制单位: | 中国医学科学院医学实验动物研究所 | 保存单位: | 中国医学科学院医学实验动物研究所 |
主要用途: | 自身免疫疾病研究。 | ||
是否通过鉴定与评价: | 否 |
1、造模因素信息
小鼠CTLA4基因位于第一号染色体的1C2区段(Chromosome 1: 60,887,000-60,915,832,ENSMUSG00000026011)
2、实验动物背景信息
c57bl/6小鼠也被称为c57 black 6,1921年被培育出来,属于近交品系。该品系的最主要的两个特点就是品系稳定和易于繁殖。另外c57bl/6小鼠是第一个完成基因组测序的小鼠品系。
3、研究背景
细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 (cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4,CTLA4)(CD152)和CD28是表达在CD4 +和CD8 + T细胞的同源受体,两者共享在抗原呈递细胞表面表达的一对配体,并且在T细胞活化中介导相反的功能。配体与CD28相互作用,介导T细胞与T细胞受体(TCR)信号共刺激。CTLA4最初被发现是一种传递抑制信号,对于终止免疫反应非常重要[1, 2]。T细胞活化受到CTLA4的负面调节,例如与CD28竞争与它们共同的配体B7.1和B7.2的结合[3]。尽管CTLA4调节免疫系统的确切机制仍存在争议,但CTLA4的抑制功能受到广泛认可[4]。所有CTLA4 敲除小鼠在淋巴结和脾脏均显示大量淋巴细胞增殖,随后白细胞对几乎所有组织进行自身免疫攻击,并导致小鼠过早死亡[1, 2, 5]。
[1] Waterhouse P, Penninger JM, Timms E, et al. Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in Ctla-4[J]. Science, 1995, 270(5238): 985-8.
[2] Tivol EA, Borriello F, Schweitzer AN, et al. Loss of CTLA-4 leads to massive lymphoproliferation and fatal multiorgan tissue destruction, revealing a critical negative regulatory role of CTLA-4[J]. Immunity, 1995, 3(5): 541-7.
[3] Sharpe AH, Freeman GJ. The B7-CD28 superfamily[J]. Nature reviews Immunology, 2002, 2(2): 116-26.
[4] Egen JG, Kuhns MS, Allison JP. CTLA-4: new insights into its biological function and use in tumor immunotherapy[J]. Nature immunology, 2002, 3(7): 611-8.
[5] Chambers CA, Sullivan TJ, Allison JP. Lymphoproliferation in CTLA-4-deficient mice is mediated by costimulation-dependent activation of CD4+ T cells[J]. Immunity, 1997, 7(6): 885-95.
3.1.4 模型构建流程
利用CRISPR /Cas9 技术,建立CTLA4基因敲除小鼠模型,利用PCR、RT-PCR和Western Blot 的方法进行鉴定及分析。
3.1.5 CTLA4敲除小鼠的建立
3.1.5.1 CTLA4敲除小鼠模型的建立
一、 载体构建
1. sgRNA 载体
载体名称:pUC57-sgRNA expression vector
Addgene ID: 51132
根据基因信息选择靶点,合成sgRNA(上海英潍捷基)
targeting site 1:
gggttcaaacacatctca agg
m-ctla4-gRNA up1 5’TAGGgggttcaaacacatctca
m-ctla4-gRNA down1 5’aaacTGAGATGTGTTTGAACCC
targeting site 2:
gagacttctggaacatgg aGg
m-ctla4-gRNA up2 5’TAGGgagacttctggaacatgg
m-ctla4-gRNA down2 5’aaacCCATGTTCCAGAAGTCTC
合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段,插入BSAⅠ线性化的载体
2,CAS9 载体
载体名称:pST1374-NLS-flag-linker-Cas9
Addgene ID: 44758
载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA(体外转录用试剂盒:Ambion Am1345)
显微注射:
1、超数排卵:15只3-4周龄c57雌鼠注射激素进行超排。
2、受精卵注射:取约150枚受精卵进行注射。
3、雄鼠结扎:制作30只8周龄输精管结扎的c57雄鼠。
4、受体鼠制备:8-10周龄ICR雌鼠与结扎的ICR雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。
5、胚胎移植:将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部(移植一次, 120枚卵,4只受体鼠)。
基因型鉴定:
1、剪尾编号:出生7-10天的乳鼠,剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。
2、基因组DNA提取: 使用全式金(Transgen)公司的基因组DNA提取试剂盒(EE101-12)提取基因组DNA
3、PCR检测:根据序列信息设计检测引物(上海英潍捷基)
M-CTLA4-KO-S 5’AGAAATTATACTCTCCAAGACTCCACG
M-CTLA4-KO-A 5’CCTTAAGTCCCAGCTGAGATCC
KO:
TM=62℃ WT:727bp ko: (见测序分析)
PCR反应体系及扩增程序(TaKaRa RR042A)
反应体系:
l 10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+ Plus) | l 2.0 μl |
l dNTP Mixture(2.5 μM) | l 1.6 μl |
l 引物-S(50 μM ) | l 0.2 μl |
l 引物-A(50 μM ) | l 0.2 μl |
l 模板DNA | l 2.0 μl |
l LA Taq | l 0.2 μl |
l 补加ddH2O至总体积 | l 20.0 μl |
扩增程序:
l 95℃ | l 15 min; |
l 95℃, 30 s l TM-2℃, 30 s l 72℃, 2 min 30循环; | |
l 72℃ | l min; |
6×loading buffer 终止反应。
用1%的琼脂糖凝胶进行电泳。
4、结果分析: 选取PCR检测分子量不同于野生型条带的 (下图中箭头所示),将PCR产物进行TA克隆,之后用检测引物进行菌液PCR,筛选有插入的克隆测序。
1-23#基因组PCR结果图(TaKaRa marker DL2000)(上游PCR结果)
1-23#基因组PCR结果图(TaKaRa marker DL2000)(KO PCR结果)
5、测序结果:
KO:4#,6#,7#,10#,15# 灰色为缺失部分
4#agaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaggcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccatggcttgtcttggactccggaggtacaaagctcaactgcagctgccttctaggacttggccttttgtagccctgctcactcttcttttcatcccagtcttctctgaaggtgagtggagacttctggaacatggaggtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaagg
6#agaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaggcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccatggcttgtcttggactccggaggtacaaagctcaactgcagctgccttctaggacttggccttttgtagccctgctcactcttcttttcatcccagtcttctctgaaggtgagtggagacttctggaacatggaggtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaagg
7#agaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaggcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccatggcttgtcttggactccggaggtacaaagctcaactgcagctgccttctaggacttggccttttgtagccctgctcactcttcttttcatcccagtcttctctgaaggtgagtggagacttctggaacatggaggtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaagg
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15#agaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaggcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccatggcttgtcttggactccggaggtacaaagctcaactgcagctgccttctaggacttggccttttgtagccctgctcactcttcttttcatcccagtcttctctgaaggtgagtggagacttctggaacatggaggtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaagg
3.1.5.2 动物繁殖和表达图谱分析
获得F0代后,首先通过与野生型C57小鼠进行杂交,进行基因修饰小鼠传代能力分析。之后CTLA4敲除小鼠通过杂合子与杂合子杂交,获得CTLA4敲除小鼠纯合子小鼠,进行蛋白表达分析,并用于后续实验。
3.1.5.3 鼠尾基因组DNA鉴定
在幼崽出生后剪脚趾标记,并剪尾至1.5 mL EP管。然后参照鼠尾直接PCR试剂盒(bimake)说明书按以下程序操作。
1.1. 按小鼠数量配制组织消化液,试剂比例如下:
| |
Protease Plus | 2 μL |
Buffer L | 100 μL |
组织消化液现用现配,充分混匀后使用。
1.2. 向每个含有样本的EP管中加入100 μL新鲜组织消化液,55℃水浴/金属浴中消化15 min。组织消化时,务必将组织完全浸没于消化液中。消化完成后,组织外观上仍然完整,但足量的基因组DNA已经释放,不影响后续的PCR实验。
1.3. 将样本置于95℃水浴/金属浴中孵育5 min以灭活消化液中的蛋白酶活性。12000 rpm离心5分钟,取上清作为PCR模板。消化后的上清或连同组织的消化液可于-20℃保存三个月。
2.1. PCR反应体系
PCR 反应组分 | 20 μL 反应体系 (μL) | 50 μL 反应体系 (μL) |
ddH2O | 8 | 21 |
正向引物 (10 μM) | 0.5 | 1 |
反向引物 (10 μM) | 0.5 | 1 |
模板(消化产物) | 1 | 2 |
2 x M-PCR OPTI™ Mix | 10 | 25 |
注:模板体积可以适当调整。 |
2.2. PCR反应条件:
温度 (℃) | 时间 | 循环数 |
94 | 5 min | 1 |
94 | 20 sec | 35 |
60 | 30 sec | |
72 | X min (2kb/min) | |
72 | 5 min | 1 |
12 | -- | 1 |
3. 琼脂糖凝胶电泳
试剂2 x M-PCR OPTITM Mix中含有溴酚蓝染料,PCR产物可直接点样进行琼脂糖凝胶电泳。
4.1 CTLA4敲除小鼠模型的建立
将F0代小鼠与C57小鼠进行杂交,获得杂合子CTLA4 +/-,将杂合子互交并将子代进行基因型鉴定,得到纯合敲除小鼠CTLA4 -/-。
4.2 CTLA4敲除小鼠生存率及体重变化
早有研究表明,CTLA4基因敲除小鼠会在出生后1月内,由于严重的自身免疫疾病死亡。我们统计了小鼠出生后的生存率及体重变化, CTLA4基因敲除小鼠在出生后3-5周内死亡。CTLA4基因敲除小鼠在出生后2周时体重与野生型小鼠相差不多,但在3-4周时体重明显轻于野生型小鼠,体型也更小。
4.3 CTLA4敲除小鼠组织中蛋白表达
为了鉴定转基因小鼠是否在蛋白水平发生CTLA4敲除,取1-2月龄小鼠脾、肺进行Western Blot,分别使用种属反应性为小鼠、大鼠和人的CTLA4抗体检测蛋白表达。
4.4 敲除CTLA4基因可导致自身免疫疾病
文献报道,CTLA4基因敲除小鼠会由于严重的自身免疫疾病,在出生后3-4周内死亡,这与我们观察到的结果相似。HE染色结果显示,CTLA4敲除小鼠表现出淋巴样细胞向非淋巴组织(如心脏、肝脏)的浸润
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