环磷酰胺诱导小鼠免疫抑制模型

一、研究背景

1、造模因素信息

  环磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）是进入人体内被肝脏或肿瘤内存在的过量的磷酰胺酶或磷酸酶水解，变为活化作用型的磷酰胺氮芥而起作用的氮芥类衍生物。抗瘤谱广，是第一个所谓“潜伏化”广谱抗肿瘤药，对白血病和实体瘤都有效。同时作为免疫抑制剂，用于各种自身免疫性疾病，如严重类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、儿童肾病综合征、多发性肉芽肿、天疱疮以及溃疡性结肠炎、特发性血小板减少性紫癜等。也用于器官移植时抗排斥反应，通常与泼尼松、抗淋巴细胞球蛋白合用。

2、实验动物背景信息

健康幼年（3周龄，10 g左右）、青年（8周龄，22 g左右）、老年（14月龄，30 g左右）雄性C57BL/6J小鼠（SPF级）。

3、研究背景

接受药物治疗的患者中，有相当一部分是特殊人群，如新生儿、婴幼儿、儿童、妊娠期和哺乳期妇女、老年人等，因其生理、生化和病理等机制与普通人群存在较大差异，有着不同的药代动力学和药效学特征，用药安全形势十分严峻。

免疫系统可以对病原体侵入人体做出适度反应，从而保持人体的内环境稳定。免疫系统的免疫应答可分为固有免疫和获得性免疫。固有免疫细胞是机体非特异免疫的重要组成部分，包括中性粒细胞、NK 细胞等；获得性免疫包括参与体液免疫的B 细胞及参与细胞免疫的T 细胞等。一般来说，人至青春期免疫系统才发育成熟，儿童免疫细胞表现出数量不足和功能不成熟。成年人的免疫系统日趋成熟，随着年龄的增长，人的免疫功能逐渐衰退，60 岁以上老人T 细胞、B 细胞、NK 细胞等会出现生成数量减少或代谢活力下降等现象。

少年儿童免疫系统发育不成熟，疾病谱与成年人多有不同。所以在用药方面在考虑有效性的同时还要考虑用药安全尤其的远期的安全性，以保证患者痊愈后的生存质量。如抗肿瘤药物的研发，儿童肿瘤多来源于中胚层，在药物选择性上与成年人不同。对药物的代谢差异也影响到了药物毒副作用尤其是对健康的远期影响都需要注意。

老年人视为“特殊人群”，因为他们在共病多、同时使用多种药物，在药代动力学、发生药物不良反应（ADR）方面与年轻人不同。医疗实践通常基于从临床试验中得出的单一疾病指南，这些临床试验不包括体弱的老年人或患有多种疾病的人。这些则易导致老年人用药不良反应事件增加。

综上，在临床前安全性研究中，采用幼年及老年动物进行实验观察逐年来引起了重视，是为临床用药提供参考数据。

环磷酰胺作为一种免疫抑制剂，已有大量研究表明其能抑制体液和细胞免疫应答，对B 细胞损伤作用尤为明显。本研究利用幼年鼠及老年鼠制备CTX免疫模型，观察CTX处理后不同年龄小鼠免疫细胞损伤及恢复情况，为特殊人群用药提供模型。

参考文献：

Barry E, Walsh JA, Weinrich SL, Beaupre D, Blasi E, Arenson DR, Jacobs IA. Navigating the Regulatory Landscape to Develop Pediatric Oncology Drugs: Expert Opinion Recommendations. Paediatr Drugs. 2021 Jul;23(4):381-394.

Davies EA, O'Mahony MS. Adverse drug reactions in special populations - the elderly. Br J Clin Pharmacol. 2015 Oct;80(4):796-807. doi: 10.1111/bcp.12596. Epub 2015 May 22. PMID: 25619317; PMCID: PMC4594722.

Wang J, Avant D, Green D, Seo S, Fisher J, Mulberg AE, McCune SK, Burckart GJ. A Survey of Neonatal Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Studies in Pediatric Drug Development. Clin Pharmacol Ther. 2015 Sep;98(3):328-35. doi: 10.1002/cpt.149. PMID: 25975723.

二、制备方法

1 动物分组与模型制备    幼年（3周龄，10 g左右）、青年（8周龄，22 g左右）、老年（14月龄，30 g左右）雄性C57BL/6J小鼠（SPF级）各32只购于北京华阜康生物科技股份有限公司。CTX组成年鼠、老年鼠腹腔注射环磷酰胺100mg/kg，分两次隔天给药，50mg/kg/次。幼年鼠腹腔注射环磷酰胺剂量为72mg/kg【同种动物间剂量换算公式：Dose(b)=Dose(a)×(W_b/W_a)^2/3,W为体重(Kg)】，分两次隔天给药，36mg/kg/次。对照组腹腔注射等剂量生理盐水。分别于给药后第3天，7天，2周，4周检测各年龄小鼠造血免疫指标。

2 主要试剂与仪器   NK1.1 ，CD11b， F4/80，CD4，CD25，Foxp3抗体购自eBioscience公司；Foxp3 Buffer Set，CD8a，B220抗体购自BD公司。注射用环磷酰胺购自江苏恒瑞医药股份有限公司（产品批号：14092925）。小鼠ELISA试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司（产品批号：70-E-EK2742(IgA) 、70-E-EK2712(IgG)、70-E-EK2762(IgM)）。137Csγ射线照射源，加拿大原子能有限公司，GAMMA-CELL40，剂量率0.80Gy/min。流式细胞仪C6（美国BD），全自动血液分析仪MEK-7222K（日本光电），酶标仪MK3（Thermo Multiskan）

3 模型评价方法

3.1 外周血血常规检测     给药后第3天、7天、2周、4周，小鼠眼内眦取血，EDTA-K3 抗凝，用全自动血细胞计数仪测定白细胞数（WBC）、淋巴细胞数、淋巴细胞百分比、中性粒细胞百分比。

3.2 器官指数测定    小鼠称重后取小鼠胸腺、脾脏称重，计算胸腺、脾脏指数（器官指数=器官重量（mg）/小鼠体重（g））。

3.3 外周血IgA、IgG、IgM测定    取10ul抗凝血浆，稀释10000倍备用。复孔加入50ul 1×检测缓冲液和50ul 2倍倍比稀释的标准品。15分钟内，样本孔加入90ul 1×检测缓冲液和10ul预稀释的样本。室温孵育2小时。洗涤后每孔加入100ul稀释的检测抗体。室温孵育1小时。洗涤后每孔加入100ul显色底物，避光，室温孵育5-30分钟。每孔加入100ul终止液。在450nm波长检测OD值。

3.4 外周血淋巴细胞分型测定    每管取50ul抗凝血，按照流式表面染色方法分别标记CD4/CD8a和NK1.1/ F4/80/B220/CD11b。室温避光孵育30min，加入1ml 红细胞裂解液，室温裂解10min。1000r/min离心5min后弃上清，缓冲液洗涤1次后加入300ulPBS，4°C保存待检。用流式细胞仪检测NK细胞、巨噬细胞（CD11b⁺F4/80⁺）、B细胞、CD4⁺T细胞，CD8a⁺T细胞比例。外周血B220细胞，CD4⁺T细胞，CD8a⁺T细胞绝对数计算方法：细胞数（10⁹/L）=B220细胞，CD4⁺T细胞，CD8a⁺T细胞在总细胞中占比×淋巴细胞数。

3.5 脾脏淋巴细胞分型测定    制备脾细胞悬液，调整细胞浓度为10^7 /ml，取100ul 细胞悬液加到EP管中。按照流式表面染色方法标记CD4/B220/CD25。4°C避光孵育30min，加入1ml 红细胞裂解液，室温避光裂解10min。1000r/min离心5min后弃上清，缓冲液洗涤一次，离心完全弃上清。分别使用Foxp3 Fixation/permeabilization buffer，permeabilization buffer 处理细胞，按照流式表面染色方法标记FOXP3，室温避光孵育20min。1000r/min离心5min后弃上清，缓冲液洗涤1次后加入300ulPBS，4°C保存待检。用流式细胞仪检测B细胞、Treg细胞(CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺)比例。

3.6 胸腺淋巴细胞分型测定    制备胸腺细胞悬液，调整细胞浓度为10^7 /ml，取100ul 细胞悬液加到EP管中。按照流式表面染色方法标记CD4/ CD8。4°C避光孵育30min，1000r/min离心5min后弃上清，缓冲液洗涤1次后加入300ulPBS，4°C保存待检。用流式细胞仪检测CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、CD4⁺CD8⁺T细胞比例。

3.7 统计学方法    采用Prism5软件处理数据、作图。各指标间两组实验数据的比较采用t检验，数据以均数±标准差（`X±s）表示。

三、评价与验证

1 环磷酰胺对不同年龄小鼠白细胞及分类的影响

为研究不同年龄小鼠免疫损伤的发生和恢复的差异，我们首先比较了环磷酰胺对不同年龄小鼠白细胞数（10⁹/L）、中性粒细胞比例、淋巴细胞比例的影响。未给药时，幼年鼠白细胞数、中性粒细胞比例、淋巴细胞比例与成年鼠相近；老年鼠白细胞数、中性粒细胞比例显著高于成年鼠，淋巴细胞比例显著低于成年鼠。 

给药后，对比WBC结果发现，成年鼠白细胞数在第3天降到52%（为了更好地反映不同年龄小鼠损伤及恢复的规律，设各年龄小鼠空白对照数据为100%，以给药组测定值/空白对照组测定值×100%作图，下同），至第7天即可恢复正常水平。幼年鼠变化趋势与成年鼠相似。老年鼠白细胞数在第3天降到27%，下降幅度远大于成年鼠，且4周后只能恢复至42%。

对比中性粒细胞比例发现，成年鼠中性粒细胞比例在第7天升高到130%，2周后可恢复至正常水平。幼年鼠中性粒细胞比例在第7天升高到221%，升高幅度大于成年鼠，2周后亦可恢复至正常水平。老年鼠中性粒细胞比例在第7天下降到59%，趋势与成年鼠相反，4周后未能恢复到正常水平。

对比淋巴细胞比例发现，成年鼠淋巴细胞比例在第7天小幅下降，下降到85%，2周后可恢复到正常水平。幼年鼠变化趋势与成年鼠相似。老年鼠淋巴细胞比例在给药后第3天即上升到119%，至第7天基本维持该水平，2周后可恢复到正常水平。

2 环磷酰胺对不同年龄小鼠器官指数的影响

在分析白细胞及分类的基础上，我们进一步观察了环磷酰胺对不同年龄小鼠免疫器官指数的影响。未给药时，幼年鼠胸腺指数显著高于成年鼠；脾脏指数与成年鼠无明显差异。老年鼠胸腺指数显著低于成年鼠；脾脏指数与成年鼠无明显差异。

对比胸腺指数发现：成年鼠胸腺指数在给药后第3天下降至58%，至第28天，只能恢复至77%。幼年鼠损伤及恢复情况与成年鼠相似。老年鼠胸腺指数在给药后第3天未有明显变化，第7天下降至55%，降至最低值时间晚于成年鼠，第14天后可恢复至正常值。

对比脾脏指数发现：成年鼠脾脏指数在第3天下降至73%，第7天略有升高，第14天后可恢复至正常值。幼年鼠在第7天下降至68%，降至最低值时间晚于成年鼠，恢复情况与成年鼠相似。老年鼠在第3天下降至40%，下降程度高于成年鼠，至第7天，基本维持损伤水平，恢复情况与成年鼠相似。

3 环磷酰胺对不同年龄小鼠胸腺淋巴细胞分型的影响

在分析免疫器官指数的基础上，我们进一步观察了环磷酰胺对不同年龄小鼠胸腺淋巴细胞分型的影响。未给药时，幼年鼠CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、CD4⁺CD8⁺T细胞比例均与成年鼠接近。老年鼠CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、CD4⁺CD8⁺T细胞比例均显著低于成年鼠。

给药后，对比CD4⁺T细胞比例发现：成年鼠在给药3天后显著降低至36%，7天后可恢复至正常值，但是4周后再次下跌至26%。幼年鼠在给药3天后，CD4⁺T细胞比例小幅下降至89%，7天后即可恢复至正常值，变化趋势与成年鼠不同。老年鼠损伤、恢复情况与成年鼠类似。

对比CD8⁺T细胞比例发现：成年鼠在给药3天后，CD8⁺T细胞比例显著下降至35%，7天后可恢复至正常值，但4周后再次下跌至13%。幼年鼠在给药3天后，CD8⁺T细胞比例下降至71%，7天后即可恢复至正常值范围，变化趋势与成年鼠不同。老年鼠损伤、恢复情况与成年鼠类似。                

对比CD4⁺CD8⁺T细胞比例发现：成年鼠在给药3天后，CD4⁺CD8⁺T细胞比例显著下降至18%，7天后可恢复至正常值，但4周后再次下降至3%。幼年鼠在给药3天后，CD4⁺CD8⁺T细胞比例下降至63%，第7天可恢复至正常值范围，至第28天，再次下降至77%，变化趋势与成年鼠不同。老年鼠损伤、恢复情况与成年鼠类似。

4 环磷酰胺对不同年龄小鼠脾脏淋巴细胞分型的影响

调节性T（Treg）细胞在调控T细胞的发育和功能中起重要作用。在分析胸腺细胞分型的基础上，我们进一步观察了环磷酰胺对不同年龄小鼠脾脏细胞分型的影响。未给药时，幼年鼠B细胞比例显著低于成年鼠；Treg细胞显著高于成年鼠。老年鼠B细胞、Treg细胞比例均显著低于成年鼠。

给药后，对比B细胞比例：成年鼠在给药后，B细胞比例持续走低，第14天达最低值43%，4周后可恢复至86%。幼年鼠、老年鼠在给药后，B细胞比例无明显变化，均与成年鼠变化趋势不同，见图4-A。

对比Treg细胞比例发现：成年鼠在给药3天后，Treg细胞比例下降至59%，至第7天下降至最低值4%，4周后可恢复至126%。幼年鼠损伤情况与成年鼠类似，但4周后仅能恢复至66%。老年鼠损伤、恢复情况与成年鼠类似。

5 环磷酰胺对不同年龄小鼠外周血淋巴细胞分型的影响

在分析脾脏细胞分型的基础上，我们进一步观察了环磷酰胺对不同年龄小鼠外周血淋巴细胞分型的影响。未给药时，幼年鼠NK细胞与成年鼠比例相近；B细胞、巨噬细胞随着年龄的增长，至第28天与成年鼠比例相近；CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞存在反跳后回落现象，至第28天与成年鼠比例相近。老年鼠巨噬细胞、CD8⁺T细胞与成年鼠比例相近；NK细胞比例高于成年鼠；CD4⁺T细胞比例低于成年鼠。

给药后，对比NK细胞比例发现：成年鼠在给药7天后NK细胞比例下降至 29%，至第28天，经过小幅反跳后恢复至106%。幼年鼠在给药后第3天，NK细胞比例无明显变化，至第7天，上升至149%，至第28天依然维持该水平，变化趋势与成年鼠不同。老年鼠在给药3天后，NK细胞比例下降至53%，至第28天，依然维持该水平，变化趋势与成年鼠不同。

对比B细胞绝对数发现：成年鼠在给药后第3天，B细胞比例骤降至2%，至第7天，可恢复至45%，第14天反跳至122%，4周后回落到57%。幼年鼠损伤及恢复趋势与成年鼠类似，恢复情况优于成年鼠。老年鼠在给药后第3天，B细胞比例骤降至1%，至第7天，可恢复至25%，至第28天，一直维持该水平，恢复趋势与成年鼠不同，且恢复能力弱于成年鼠。

对比巨噬细胞比例发现：成年鼠在给药3天后，巨噬细胞比例骤降至20%，至第7天反跳至192%，至第28天可恢复至正常值。幼年鼠变化趋势与成年鼠类似。老年鼠：在给药后第3天，巨噬细胞比例骤降至14%，至第7天回升到144%，至第28天回落到56%，变化趋势与成年鼠不同。

对比CD4⁺T细胞绝对数发现：成年鼠在给药3天后，CD4⁺T细胞比例骤降至4%，至第7天即可恢复正常值范围。幼年鼠在给药3天后，CD4⁺T细胞比例下降至30%，至第7天仅能恢复至47%，第14天可恢复正常值范围，恢复能力弱于成年鼠。老年鼠在给药3天后，CD4⁺T细胞比例骤降至1%，7天后仅能恢复至58%，第14天小幅回升，至第28天跌至63%，恢复情况弱于成年鼠。

对比CD8⁺T细胞绝对数发现：成年鼠在给药3天后，CD8⁺T细胞比例骤降至3%，至第7天，可恢复至70%，第14天时小幅回升，至第28天可恢复至正常值。幼年鼠在给药后第3天，CD8⁺T细胞比例下降至20%，7天可恢复至39%，2周时可恢复至122%，恢复能力弱于成年鼠。老年鼠在给药后第3天，CD8⁺T细胞比例骤降至3%，至第7天可恢复至83%，此后仍维持该水平，恢复情况弱于成年鼠。

6 环磷酰胺对不同年龄小鼠血浆IgA、IgG、IgM含量的影响

在分析外周血淋巴细胞分型的基础上，我们进一步观察了环磷酰胺对不同年龄小鼠血浆IgA、IgG、IgM的影响。未给药时，幼年鼠IgA、IgM含量与成年鼠相近，IgG含量显著高于成年鼠。老年鼠IgA、IgG、IgM含量均显著高于成年鼠，给药后，对比血浆IgA含量发现：成年鼠在给药后第3天，IgA含量下降至7%，至第2周，依然维持在较低水平，至第4周可恢复至83%。幼年鼠在给药后第3天，IgA含量下降至62%且至第4周可完全恢复。损伤恢复情况优于成年鼠。老年鼠变化趋势与成年鼠基本一致。

对比血浆IgG含量发现：成年鼠在给药后第3天，IgG含量骤降至5%，至第7天，依然维持较低水平且4周只能恢复至原来的50%。幼年鼠在给药后第7天，IgG含量下降至38%，至第2周即可完全恢复。老年鼠损伤情况与幼年鼠相似，但恢复缓慢，至第4周只能恢复至75%。

对比血浆IgM含量发现：成年鼠在给药后第3天，IgG含量降至37%，至第4周可完全恢复。幼年鼠、老年鼠变化情况与成年鼠基本一致。

四、生物安全性

在制备模型使用环磷酰胺，应注意戴手套和口罩。剩余药品及污染器械要注意安全处理。

五、讨论和结论

6岁以下的儿童处于“免疫功能不全期”，自身免疫系统发育还未成熟，免疫系统较易受到攻击。在一些疾病的急性期，儿童常发生免疫细胞紊乱，而引起继发感染。有研究表明，到2025年，中国将进入重度老龄化社会。随着年龄的增长，人体免疫系统功能将逐渐衰退。免疫功能不足对老年人的健康产生极为不利的影响。目前，许多老年病需要长期用药，部分药物会产生免疫系统损伤的毒副作用，老年人在应用这类药物后，相较成年人，对损伤会更敏感且恢复更缓慢。

本实验以环磷酰胺为阳性药物，可为日后评价对儿童、老人免疫系统有损伤作用的药物提供基础数据。我们亦对比了幼年、成年、老年鼠外周血、胸腺、脾脏免疫细胞的相关参数以及应用免疫抑制剂造模后的参数变化，为儿童、老人应用对免疫系统有调节作用的药物时提供参考。

六、鉴定和评论的其他材料

1. 林帅，陈孟毅，刘冰，李程程，李德冠，吴丽贤，孟爱民. 环磷酰胺对不同年龄小鼠免疫细胞损伤及修复作用的影响. 中国医药导报，2016，13（36）：8-13,35

2. 陈孟毅, 林帅, 吴丽贤, 刘冰, 李程程, 李德冠*, 孟爱民*. 不同年龄小鼠造血系统辐射损伤与修复的比较观察 [J] .国际放射医学核医学杂志,2019,43( 5 ): 442-449.

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