过敏性紫癜大耳白兔模型

一、研究背景

一、疾病概况

过敏性紫癜（allegric puprura，AP），又称亨-舒综合症（Henoch-Schönlein purpura，HSP），是一种常见的血管变态反应性出血性疾病，以广泛的小血管炎为病理基础，皮肤紫癜、消化道粘膜出血、关节肿胀和肾炎等症状为其主要临床特征，是儿童中发病率最高的血管炎性病。流行病学研究提示，HSP的发病率为（10~22）/10万，好发年龄为3~10岁，并发症多，过敏性紫癜性肾炎（Henoch-Schönlein purpura nephritis，HSPN）是最严重的并发症。该病复发率高，病程迁延，患病率逐年升高，现代医学对其治疗无满意效果。

鉴于直接进行人体实验的局限性，在很大程度上需要通过动物实验进行，所以HSP动物模型在整个HSP的研究中具有举足轻重的作用。目前，关于过敏性紫癜动物模型构建的报道很少，因此对该病病因、发病机制、临床治疗评价和药物开发在一定程度上受到限制。

二、发病机制

病因不明确，一般认为与过敏有关，致敏原可能为食物、感染、药物、花粉或昆虫叮咬等，临床上常不确定。致敏原进入机体刺激浆细胞，产生抗体，与抗原结合形成免疫复合物，主要是IgA免疫复合物，过多的免疫复合物不易被巨噬细胞清除，刺激5-羟色胺、组胺等血管活性物质释放，血管壁通透性增加，组织水肿。免疫复合物在血管壁或肾小球膜上沉积，产生过敏毒素，使中性粒细胞在沉积处聚集，并释放蛋白水解酶，局部组织血管损伤加剧，沉积在胃肠黏膜小血管，引起胃肠道出血。该发病机制类似于可溶性免疫复合物引起的III型超敏反应。然而在相同条件下，很多人接受相同抗原刺激后，并未发生过敏性紫癜，而有些人则首次接触这些抗原刺激即可发生致敏反应，说明患过敏性紫癜的人需具备特异反应体质，并且研究发现这种特异反应体质具有家族倾向性，即基因易感性。

二、制备方法

1．实验动物

1.5月龄日本大耳白兔24只，12只雌雄各半为模型组，12只雌雄各半为对照组，体重1.2～1.4kg，普通级动物房饲养。

2.模型构建

1）过敏体质的构建

中医热性药物干姜、荜茇、胡椒水煎剂以1:1:1的比例混合成15%的水溶液，4℃保存备用。动物适应1周后，模型组口服给药，1次/日，连续3周，对照组给以等量生理盐水，其它条件相同。

2）抗原致敏

腹腔注射卵白蛋白生理盐水与弗氏完全佐剂以1:1比例混合的乳化溶液1 mL，1次/周，连续3 周。对照组腹腔注射等量的生理盐水。

3）抗原激发过敏反应

腹腔注射致敏3周后，动物耳缘静脉和皮内分别注射1%和0.3%卵白蛋白生理盐水，激发过敏反应。之后观察动物皮肤红肿状况，照相存档。

四、模型主要鉴定方式

非血小板减少性皮肤紫癜症状、血尿常规和便潜血、病理改变（包括炎症反应炎细胞浸润、IgA免疫复合物沉积等）、血免疫指标（血清IgA及相关免疫细胞及细胞因子）等。

三、评价与验证

  1. 模型的皮肤特征

兔耳缘静脉及皮内注射卵白蛋白生理盐水溶液后，皮肤注射部位均会出现直径1 cm左右的皮丘，6 h后模型组兔的背部皮丘逐渐变大，且周围水肿，皮内血液渗出；至18h左右，呈现片状紫斑，直径2-10mm，形状不规则，大小不等，还有一些斑点出现在耳朵和腿部。在激发第8天左右，皮肤紫癜开始变小，渗出减少，20天左右，症状明显改善。皮肤症状出现的比例约为85%。

2. 模型病理特征

（1）脏器组织形态学改变

模型动物病理表现为皮下出血，真皮水肿，血管扩张充血、出血，炎细胞浸润；肾小球囊腔蛋白渗出物，血管扩张充血及局灶性慢性肾炎，肾小球系膜基质增多，系膜增厚，红细胞管型，炎细胞浸润等；还可见到关节腔滑膜淤血，结缔组织坏死，炎细胞浸润等；胃黏膜可见出血，坏死脱落；小肠绒毛血管扩张充血，上皮细胞脱落；肺淤血，肥大细胞似有脱颗粒现象；肝灶性炎细胞浸润等等。

（2）皮肤、肾脏免疫复合物沉积

免疫荧光检测发现IgA免疫复合物在模型组兔皮肤主要沉积在皮肤真皮层血管壁、肾小球系膜区，血管壁及肾小球入球小动脉壁，常呈斑点状、团块状、分支状或短线状分布。

（3）肾小球纤维增生性改变

肾脏Masson染色结果显示模型组动物（a）肾小球系膜纤维化增生，胶原纤维蛋白增多，使得系膜增厚，基质增多，与（c）图PAS染色结果模型组兔肾小球系膜增生，系膜基质增厚相一致。

（4）皮肤和肺脏的嗜酸性细胞浸润

嗜酸性粒细胞的皮肤和肺脏Luna染色，表现为单位面积（1mm²  ×40倍）视野内模型组兔皮肤真皮层和肺间质内嗜酸性粒细胞明显增多

（三）血尿常规及便潜血改变

血白细胞WBC升高，RBC相对于减少，PLT数量激发后无差异性改变，NEU、NEU%均升高，EOS、EOS%升高。尿液变稠表面观察有拉丝现象，气味大，67%尿蛋白阳性，尿红细胞阳性；实验前便潜血检测阴性，激发实验后70%便潜血阳性。

     长春中医药大学4～12岁，住院 2～5天的12名患者血常规检测白细胞（WBC），粒细胞（Gran），单核细胞（MONO）及百分比MONO% 明显增加，分别超出正常范围的百分比为33.3% (4/12)，25% (3/12)，41.6% (5/12)，33.3% (4/12)。淋巴细胞百分比（LYMPH%）明显减少，低于正常参考范围的比例为25% (3/12)，血小板未见明显异常改变

（四）模型血免疫指标改变

HSP兔血清IgA升高，IgG降低，C3，C4减少，IgE无明显改变。外周血CD3⁺T细胞数目减少，CD4⁺T细胞减少，CD8⁺T细胞增多，CD8⁺T细胞所占百分比升高，CD4⁺T细胞百分比下降，IL-2水平下降，TNF-α水平升高。

长春中医药大学4～12岁，住院 2～5天的12名患者血清IgA， IgE升高（p<0.01），IgG升高（p<0.05），C3，C4减少（p<0.05）。血CD4+T细胞百分比下降，CD4/CD8比值下降，IL-4、TNF-α水平升高，差别均具有统计学差异。

四、鉴定和评价的其他材料

1.李彦红，朱华，隋小龙，徐艳峰，杨亚军，孙井江，黄澜，徐玉环，韩云林，冯晓纯，秦川*.初步探讨过敏性紫癜兔模型的构建，中国实验动物学报，2013,21(5):36-41

2.李彦红，朱华，徐艳峰，黄澜，隋小龙，徐玉环，冯晓纯，秦川*.过敏性紫癜兔模型的免疫学改变及机制初探，中国实验动物学报，2013,21(6):65-69

3.Yanhong Li, Xiaochun Feng, Lan Huang, Hua Zhu, Yanfeng Xu, Xiaolong Sui, Yuhuan Xu, Yunlin Han, Chuan Qin*. Hematologic and immunological characteristics of Henoch-Scho¨nlein purpura in rat and rabbit models induced with ovalbumin based on type III hypersensitivity, Scientific Reports，2015，5(8862)：1- 6.

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