关节炎小鼠模型

一、研究背景

一、疾病概况

类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种以滑膜持续炎症和关节软骨及骨破坏为特征的慢性进行性的自身免疫性疾病，以关节滑膜炎及对称性、破坏性的关节病变为主要特征。RA在我国的发病率为0. 26%~0. 5%，能够发生于任何年龄，女性发病多于男性^[1]。RA炎症反应造成患者机体肉芽组织和纤维增生，使得关节腔内的血供严重受损；严重的缺血使得局部出现坏死，以累及周围关节为主，故其基本病理改变为滑膜炎^[2]。主要临床表现为关节肿痛，继而软骨破坏、关节间隙变窄，晚期因严重骨质破坏、吸收导致关节僵直、畸形、功能障碍。

该疾病为一种反复发作性疾病，致残率较高，预后不良，目前还没有很好的根治方法。

二、发病机制

类风湿性关节炎的发病的主要因素有：（1）B细胞的介导作用与自身抗体的产生；（2）T细胞、巨噬细胞的介导作用与细胞因子网络；（3）遗传因素。但就目前来讲，RA的病因及发病机制尚不完全明确，其可能与具有某些遗传特征的人群对一些抗原刺激具有敏感性而引发的免疫应答反应所导致的病理性改变有关。免疫调节机制、功能障碍是导致RA的主要机制，在RA患者的滑膜组织中出现异常增多的T、B淋巴细胞和白细胞介素、趋化因子、干扰素等细胞因子以及自身抗体等均提示这些物质有可能参与RA的发生和发展^[1]。

二、制备方法

1、实验动物

C57BL/6J小鼠，属动物界、脊索动物门、哺乳纲、啮齿目、鼠科、小家鼠种（Mus musculus），1921年Abby Lathrop得到动物后开始近亲交配，育成数个近交系。本实验中于SPF级动物房饲养。

2、模型构建

使用8~9周龄的C57BL/6J雌性小鼠，分为两组，每组各6~7只。

关节炎诱导试剂为Chondrex公司生产的Arthrogen-CIA^®Arthritogenic Monoclonal Antibody试剂盒。

对于模型组小鼠，每只腹腔注射5mg胶原抗体混合物，记为第0天，第3天时腹腔注射25~50μg LPS，能够快速诱导发病；第10~11天可选择性地再次注射25~50μg LPS，使加重病情，延长发病周期，继续观察。对照组在同样的时间腹腔注射等体积的PBS。

三、评价与验证

 1、模型的形态特征

患病小鼠四肢的脚趾、脚掌以及踝部关节会出现红肿，严重则关节僵直，行动受阻。

对小鼠的发病情况进行统计学分析，模型组小鼠在第3天发病，病情在第9~10天达到一个高峰状态；第10~11天可选择性地再次注射25~50μg LPS，延长发病周期，病情加重，在第14~15天以后病情逐渐缓解。若不进行二次注射，炎症症状则从第11天开始逐渐下调。

模型组小鼠在第8天发病率达到100%，对照组全部不发病，模型组小鼠四肢发病数平均在3~4肢，在第12天病情达到最高峰，对照组不发病。测量小鼠的踝部关节以及脚掌肿胀厚度，根据病情严重程度为其打分：足部无红肿，不发病——0分；1~2个脚趾红肿，或有轻微的红肿或红斑——1分，3~5个脚趾红肿或足部有较明显的红肿——2分；整个足部严重红肿，关节僵直——3分；每只动物最高分数为12分。对照组不发病故全部分数为0。

2、模型的病理特点

（1）组织切片染色进行病理学分析

实验进行至第18~19天，处死动物收集样本。取小鼠四肢（主要为足部部分）浸没于10%中性福尔马林中进行固定，随后经甲酸脱钙后，石蜡包埋，切片，苏木素伊红（HE）染色，显微镜下观察。

模型组小鼠样本，表现为软骨受侵蚀，关节囊纤维组织增生，炎细胞浸润，骨质受破坏，滑膜细胞脱落，腔内积液等。对照组其软骨面完整平滑，无增生与积液现象，表现正常。

（2）CT检测骨骼损伤情况

    将经10%中性福尔马林固定后的小鼠足部样本进行CT扫描拍片，观察其足部的骨骼损伤情况。模型组小鼠骨骼，骨骼表面不平整，扭曲变形，新生骨与破骨并存，骨骼损伤严重。骨骼表面与腔内平滑，正常无损伤。

（3）模型组织中细胞因子表达情况的分析

检测小鼠关节与血液中几种主要的促炎性细胞因子的表达情况。其中IL-6、IL-17、TNF-α都是在炎症反应中起重要作用的促炎性细胞因子。IL-6对破骨细胞介导的骨质吸收、滑膜炎等炎症进程起关键作用，也是机体炎症反应的标志性细胞因子。IL-17是一种主要由活化T细胞产生的促炎性细胞因子，在T细胞介导的滑膜炎、骨破坏等过程起关键调节作用，是关节炎发生发展中最标志性的调节因子之一。TNF-α能够促进粘附分子和蛋白酶表达，在骨破坏以及滑膜细胞增生等过程中起重要作用^[3]。因此，这些促炎性细胞因子的表达水平反应了病情的严重程度。

取得小鼠关节样本，提取RNA，反转录得到cDNA，通过Real-Time PCR检测关节中促炎性因子的相对表达量；提取小鼠血清，通过流式细胞术进行分析，检测血清中促炎性因子的表达量。虽然在取样时间段（第18~19天）炎症反应正逐渐下调，关节与血清中的IL-6、IL-17、TNF-α的表达量仍然高于正常水平。

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