SARS-CoV-2感染转基因小鼠模型

研究背景

新型冠状病毒肺炎起病以发热为主要的临床表现，可合并轻度干咳、乏力、呼吸不畅、腹泻等症状，流涕、咳痰等，咯痰症状少见。一半患者在一周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。部分患者起病症状轻微，可无发热等临床症状，多在1周后恢复。多数患者预后良好，少数患者病情危重，甚至死亡。

从影像学表现来看，早期呈现多发小斑片影及间质改变，以肺外带明显。进而发展为双肺多发磨玻璃影、浸润影，严重者可出现肺实变，胸腔积液少见（图1）。

图1. COVID-19患者影像学分析，来自公开报道数据

从免疫学表现来看，患者还可出现发病早期外周血白细胞总数正常或减低、淋巴细胞计数减少，部分患者出现肝酶、肌酶和肌红蛋白增高。多数患者C反应蛋白和血沉升高，降钙素原正常。严重者D-D二聚体升高，淋巴细胞进行性减少。

从组织病理学表现来看，患者表现为间质性肺炎，肺泡腔大量的多核巨细胞和巨噬细胞浸润，肺泡比弥漫性增厚，肺泡间隔增宽（图2）。

图2. COVID-19死亡病例肺组织病理，来自公开报道数据

2. 研究目的和意义

利用SARS-CoV-2感染表达人SARS-CoV受体ACE2的转基因小鼠，观察并检测感染后的临床症状、病原学和病理学等指标，获得SARS-CoV-2感染引起肺炎发生、发展的动态数据，构建转基因小鼠模型，满足致病机制、疫苗和药物评价、传播途径等研究对动物模型的需求。

3. 国内外研究现状

2019年底，在中国湖北武汉华南海鲜市场爆发的新型冠状病毒感染肺炎（COVID-19）疫情^[1]，已经波及全中国及其他许多国家，被世界卫生组织定义为“国际关注的突发公共卫生事件”^[2]。当务之急是要找到预防和治疗新型冠状病毒的有效措施，因此，研究新型冠状病毒在体内的致病机制迫在眉睫。构建新型冠状病毒肺炎的动物模型，不但为了解该疾病的致病性和病理损伤特征打下基础，也是评价相关药物和疫苗的有效性和安全性时，不可或缺的工具和科技支撑。

因为新型冠状病毒（SARS-CoV-2）和严重急性呼吸系统综合症冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）具有高度的同源性，而SARS病毒进入人体的特异性受体为人血管紧张素转化酶2（human Angiotensin-converting enzyme 2，hACE2）^[3]。科研人员经过大量的分子生物学分析表明，新型冠状病毒很有可能利用同样的受体hACE2入侵人体。因此，我们选择hACE2转基因小鼠作为感染新型冠状病毒的模型动物，用以构建SARS-CoV-2感染小鼠模型。

制备方法

1  试验材料

1.1 病毒株

SARS-CoV-2（原2019-nCoV, HB-01），由中国疾控中心谭文杰教授提供，新型冠状病毒的全基因组序列可以在GISAID (BetaCoV / Wuhan / IVDC-HB-01 /2020|EPI_ISL_402119)获得，存放于中国微生物数据中心（登录号NMDC10013001，基因组登录号MDC60013002-01）。

1.2 试验动物

选择SPF 级6 周至 11月龄各段的ICR 与 C57 BL/ 6J，18-22 g，来自中国医学科学院医学实验动物研究所（IACUC 批准号：BLL20001）

2  试验操作规程

2.1 人 hACE2转基因小鼠的制备

表达人 hACE2 基因的小鼠，由小鼠ACE2 启动子驱动，经 RT-PCR 和 Western blot 验证 hACE2 基因在小鼠肺组织内的表达（图3）^[4]。

2.2 病毒传代

将新型冠状病毒接种到Vero细胞进行分离和储存。Vero细胞培养在DMEM（英潍捷基, 美国）添加10%胎牛血清，100 IU/ml 青霉素和100 μg/ml链霉素的培养基中，环境为37°C，5%CO₂。新型冠状病毒的病毒滴度用标准的半数细胞感染率（a standard 50% tissue culture infection dose，TCID₅₀）进行分析。

2.3 动物模型的感染方法

（1） 途径：滴鼻；

（2） 感染剂量：1× 10⁵ TCID₅₀ 只；

（3） 感染体积：50 μl 只；

（4） 对照组：等体积 PBS。

2.4 动物模型分析

（1）症状观察：感染后，每天观察动物一般症状，记录体重。

（2）病毒载量：定时收集各组动物脏器，进行RNA抽提，利用RT-PCR技术，检测组织中病毒载量。RT-PCR所用的新型冠状病毒引物如下：上游为5’-TCGTTTCGGAAGAGACAGGT-3’ 下游为5’-GCGCAGTAAGGATGGCTAGT-3’。

（3）病毒分离：肺组织在 DMEM 溶液中研磨制备成匀浆，离心分离上清后，接种于Vero细胞分离病毒并观察细胞病变。

（4）病理学观察 用新鲜的组织制备冰冻切片，将组织固定在冷冻剂上，肺脏组织（10um）切好后在 100% 丙酮内固定 15 分钟，之后用 HE染色，镜下观察。

（5）免疫荧光染色肺脏切片用PBS洗三遍，用固定液充分固定，用封闭液室温封闭 1h，一抗4°C 封闭过夜，PBS洗三遍，二抗37°C 孵育1 小时， PBS 洗三遍。用 DAPI 染细胞核观察新型冠状病毒在小鼠肺脏上的定位。新型冠状病毒一抗为病人恢复期血清，羊源抗人二抗用， FITC 标记。

（6）感染后第14天，分离血清，测定特异性IgG。

2.5 数据统计处理方法

所有的数据用GraphPad Prism 6.0 软件分析，感染组小鼠和其他对照组小鼠用T 检验方法分析差异，显著性差异用*p ﹤ 0.05, **p﹤0.01 或者 #p﹤0.05, ##p﹤0.01 表示。

评价与验证

1. 动物模型评价方法

本实验建立的新型冠状病毒动物模型采用监测临床症状、病毒学和病理学 等方法进行分析和鉴定，确定该动物模型成功建立 。

（1）大体观察：临床症状观察包括动物的体重变化一般症状观察（弓背、竖毛、反应度降低等）等。动物感染后主要表现为明显的体重下降，部分动物竖毛，没有其他明显的症状。与其他传染病动物模型类似，体重下降百分比与疾病状态正相关。

（2） 病毒学监测发现，在肺组织中可以检测到病毒 RNA 并能分离到活病毒，在组织匀浆中电镜下可以观察到病毒颗粒，证实从被感染动物中可以分离到病毒，分别在感染后第3天和第5天检测到肺组织病毒载量，在病因上成功模拟 COVID 19。

（3）病理学检测发现，被感染动物的肺组织出现间质性肺炎呈弥漫性中度间质性肺炎改变，可见肺泡隔增宽、炎细胞浸润，血管周围炎细胞浸润，肺泡腔内可见巨噬细胞及少量蛋白渗出，在间质性肺炎和巨噬细胞浸润方面与临床一致。

以上三项指标模拟了新型冠状病毒感染肺炎病人的主要指标 ，证明小鼠模型成立。

2.评价指标体系

根据模型的主要表现，该模型用于研究、疫苗和药物评价时，与模型对照组相比，主要检测干预组的三类指标：

（1）体重下降百分比

与模型对照组相比，观察感染小鼠的体重下降百分比改变情况。

（2）肺组织内病毒载量

与模型对照组相比，检测感染小鼠第3天和第5天肺组织内病毒载量变化情况。

（3）肺组织病理改变

与模型对照组相比，检测感染小鼠间质性肺炎的病理学改变情况。

3. 实验结果

3.1 临床表现

hACE2转基因小鼠感染后一般状态尚可，部分小鼠出现竖毛。感染后小鼠体重出现下降，感染 5天时平均体重下降百分比达到5%（图4）

3.2  病毒学检测

（1）病毒分离

感染第3天和第5天从肺组织分离病毒，匀浆接种Vero细胞，可发生有明显的细胞病变（图5），在电子显微镜下观察到病毒的特征性结构（图6）。而对照组小鼠没有观察到任何异常现象。

（2）病毒载量

在小鼠感染后第三天和第五天分别收集主要脏器，用以检测病毒在小鼠体内的分布情况。 RT PCR 结果显示，感染后 hACE2 转基因小鼠，只有在肺脏显现出病毒明显存在（图7）。 感染3 天后，肺组织中病毒载量可达到 10^6.5 拷贝/ml 感染 5 天后，肺组织中病毒载量可达到 10 ^5.0 拷贝/ml（图 8）。

（3）病毒抗原检测

在小鼠感染后第三天和第五天分别收集主要脏器，用免疫荧光检查病毒在小鼠体内的分布情况，发现病毒主要分布于肺脏支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞内 （图9）。

3.3  病理学检查

（1）肺部大体病理

与对照组相比，感染小鼠肺脏大体病理表现为，肺脏表面出现局灶性病变损伤，呈暗红色。

（2）肺部组织病理

用免疫组化观察了肺组织内病毒抗原分布，发现抗原 分布于支气管上皮细胞（蓝箭头）、肺泡上皮细胞（黑箭头）和巨噬细胞（红箭头）（图11）。

图11. 免疫组化观察肺组织内病毒抗原分布. 400 ×.

小鼠感染后肺组织呈弥漫性中度间质性肺炎改变，可见肺泡隔增宽、炎细胞浸润，血管周围炎细胞浸润（黑色箭头），肺泡腔内可见巨噬细胞（蓝色箭头）及少量蛋白（绿色箭头）渗出（图12）

图12. 感染小鼠肺组织病理

3.4  抗体检测

感染小鼠第14天分离血清，检测到特异性IgG产生（图13）。

图13. 第 14天血清中抗体检测

生物安全性

所有涉及的病毒实验操作全部在中国医学科学院医学实验动物研究所 ABSL 3 实验室完成，该实验室已经具备相关实验室和福利伦理资质。

讨论和结论

目前没有确证 有效的阳性药物，本单位用细胞模型从市售成药中筛选有效药物，发现 PHD1（药品代号）可以在细胞水平抑制病毒复制，随后用小鼠模型进行了药效学评价。发现药物治疗感染小鼠后，临床症状得到改善，病毒复制被显著抑制，肺组织病理明显改善，证明该药物可治疗感染小鼠。

鉴定评价和其他材料

参考文献:

[1]. Zhu, N., et al., A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019. New England Journal of Medicine, 2020.

[2]. Wang, C., et al., A novel coronavirus outbreak of global health concern. The Lancet, 2020.

[3]. Lu, R., et al., Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: impli cations for virus origins and receptor binding. The Lancet, 2020.

[4]. Yang XH 1, et al., Mice transgenic for human angiotensin converting en zyme 2 provide a model for SARS coronavirus infection. Comp 2007 Oct;57(5):450 9.

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