SARS-CoV-2感染hACE2-KI/NIFDC人源化小鼠模型

研究背景

自2019年12月以来，新型冠状病毒SARS-CoV-2出现并迅速传播到世界各地，导致全球公共卫生突发事件。目前迫切需要动物模型对疫苗和抗病毒药物进行评价。我们通过使用CRISPR / Cas9敲入技术生成了稳定的人源化ACE2小鼠，用人ACE2替代了内源性小鼠ACE2（mACE2）。这些人源化小鼠通过鼻内接种对SARS-CoV-2感染高度敏感。这种小鼠模型为研究SARS-CoV-2的感染和传播提供了有用的工具。

根据承担的传染病动物模型课题要求，储备病毒易感动物模型，用该动物模型研究hACE2基因功能。

         Shi-Hui Sun,1,7 Qi Chen,1,7 Hong-Jing Gu,1,7 Guan Yang,2,7 Yan-Xiao Wang,2,7 Xing-Yao Huang,1,7 Su-Su Liu,3 Na-Na Zhang,1 Xiao-Feng Li,1 Rui Xiong,3 Yan Guo,1 Yong-Qiang Deng,1 Wei-Jin Huang,4 Quan Liu,3 Quan-Ming Liu,3 Yue-Lei Shen,5 Yong Zhou,6 Xiao Yang,2 Tong-Yan Zhao,1 Chang-Fa Fan,3,* Yu-Sen Zhou,1,* Cheng-Feng Qin,1,* and You-Chun Wang4,8,*.  A Mouse Model of SARS-CoV-2 Infection and Pathogenesis. Cell Host & Microbe 28, 1–10, July 8, 2020

制备方法

为了构建靶向载体，将编码hACE2的cDNA通过同源重组的方式插入到mACE2的第一个编码外显子中，该cDNA通过IRES序列与红色荧光蛋白tdTomato相连，并带有WPRE和ployA。插入的hACE2和tdTomato基因由小鼠mACE2启动子驱动表达。将特异性靶向sgRNA(5‘-gaaagatgtccagctccctcctctctctctgg-3’)和Cas9mRNA显微注射到C57BL/6受精卵中，然后植入假孕小鼠体内。用两对引物L-GT-F1、L-GT-R1和R-GT-F1、R-GT-R1对F0代进行基因分型(表S2)。预期扩增大小分别为4188bp和4405bp。将基因型阳性的创建者与C57BL/6小鼠回交，产生F1代小鼠。对F1阳性小鼠的DNA样本进行Southern blotting，以确认脱靶(WPRE 3‘探针)和正确插入(5’探针)。用NcoI(Thermo)和StuI(Thermo)两种内切酶对DNA进行酶切，以确定正确的插入，没有随机重组。

鼻内感染小鼠，将野生型C57BL / 6小鼠（年轻（4.5周）和年长（30周））通过腹膜内途径用戊巴比妥钠以50 mg / kg的剂量麻醉，然后经鼻内感染4 ×10 ⁵ pfu的SARS-CoV-2。为了确认hACE2和mACE2在人源化小鼠中的表达进行RNA提取和实时定量PCR，为了对模型进行鉴定进行病毒RNA载量的测量，免疫组化、细胞因子测定、组织病理学分析。

评价与验证

该模型中，通过Q-PCR、WB杂交，免疫组化证明hACE2基因能表达。攻毒实验显示，该模型对新冠病毒易感，能引起间质性肺炎。

将hAce2基因插入X染色体上的GRC m38.p6位点替换mAce2，在纯合hACE2小鼠中没有内源性mACE2表达。ACE2小鼠对鼻内感染的SARS-CoV-2高度敏感，并且在肺克拉拉细胞以及气管和大脑中都具有持续稳定的病毒RNA复制。hACE2在小鼠模型中的组织分布与COVID-19患者的临床检测结果相符，并且在肺中检测到高水平的hACE2表达。所有经SARS-CoV-2鼻内攻击的hACE2小鼠均发展为间质性肺炎，其特征在于炎症细胞浸润，肺泡间隔增厚和独特的血管系统损伤，从而重现了大多数COVID-19患者的临床特征。

H＆E染色显示，年轻和年长的hACE2小鼠均患有间质性肺炎，其特征为炎性细胞浸润，肺泡间隔增厚和独特的血管系统损伤。在老年小鼠中观察到更多的肺泡上皮细胞损伤和局灶性出血。IHC染色分析显示，SARS-CoV-2感染在老年hACE2小鼠中产生了更多的中性粒细胞（Neu +）和巨噬细胞（CD68 +）浸润。此外，免疫荧光共染色显示SARS-CoV-2直接感染了肺中的CD68 +巨噬细胞，导致了hACE2衰老小鼠中显着的细胞凋亡（C-Casp3 +）。Luminex细胞因子分析表明，SARS-CoV-2感染导致衰老的hACE2小鼠细胞因子产生增加，包括嗜酸细胞活化趋化因子，G-CSF，IFN-γ，IL-9和MIP-1β。

该模型已经大量用于我国抗体、疫苗和药物评价，至少已经推动两个疫苗制品、一个抗体制品进入临床研究；论文发表包括Science，Nature等多篇论文。

生物安全性

将4.5周和30周龄的hACE2和野生型C57BL / 6雌性小鼠用于SARS-CoV-2感染组保存在23°C的AMMS动物生物安全等级3（ABSL3）实验室中。所有动物实验均已由NIFDC实验动物委员会（批准号：2018-B-002）和AMMS实验动物中心（批准号：IACUC-DWZX-2020-001）批准。

讨论和结论

人血管紧张素转换酶II（ACE2）已被确定为SARS-CoV-2的功能受体。我们通过使用CRISPR / Cas9敲入技术生成了表达人ACE2（hACE2）的小鼠模型。与野生型C57BL / 6小鼠相比，年轻和年老的hACE2小鼠在鼻内感染后均在肺，气管和大脑中维持较高的病毒载量。虽未观察到死亡，但在SARS-CoV-2感染的hACE2小鼠中发现了间质性肺炎和细胞因子升高。在hACE2小鼠中，SARS-CoV-2的胃内接种可引起生产性感染并导致肺部病理变化。在老年hACE2小鼠中观察到的病理变化与在COVID-19患者中观察到的病理变化更相似。总体而言，此模型为研究SARS-CoV-2的传播和发病机制以及评估COVID-19疫苗和治疗剂提供了有用的工具。

全球第一个人源化小鼠模型，带有特殊标记基因，大量使用，目前已经提供1700多只。

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