IFITM6敲除小鼠模型

一、研究背景

一、疾病概述

      固有免疫是机体防御外来病毒感染的第一道防线，通过识别病原并产生各种细胞因子、趋化因子、干扰素（IFN）等多种抗病毒因子。干扰素诱导的跨膜蛋白（IFITM家族），是一类具有抗病毒作用的ISG（干扰素诱导基因）的编码产物，并证明其在多种生物过程中发挥作用，具有广泛的抗病毒作用，并在免疫信号转导、细胞归巢等发挥作用。

      IFITM家族包括IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5、IFITM6、IFITM7和IFITM10，除了IFITM5特异性表达与骨细胞，不依赖与IFN的表达，其余家族在IFN的调控下在多组织和器官广泛表达。其中，FITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5和IFITM10在人类中表达，FITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5和IFITM6在小鼠中表达。

      IFITM家族具有两个输水区，被一个称为保守型细胞内环结构（CTL）保守区分开。IFITM在不同组织和细胞中，分布相对广泛。IFITM1主要位于细胞膜和早期内体，能够与细胞表面分子CD19和CD81相互作用。报道显示CD81是HCV的受体，表明IFITM1可能与HCV感染进入细胞存在相关性。IFITM2和IFITM3主要存在于晚期内体和溶酶体，并于Ras相关蛋白RAB7、CD63和LAMP1共定位。通过功能基因组筛选，发现IFIMT1、IFIMT2、 IFIMT3，能够被1型和2型IFN诱导表达，并对于IFN抑制流感性病毒发挥重要作用。IFITM3基因敲除小鼠模型，在感染流感病毒后引起爆发性病毒肺炎，重新基于IFIMI3可以逆转病情。已有的研究还表明IFIMT家族还参与Th1和Th2细胞的分化调节。IFIMT5参与成骨细胞和矿物盐沉积。IFITM10在不同物种中的同源非常高，高达85%以上，但是功能仍是未知。通过敲除小鼠的IFITM3, IFITM5，和IFITM 6基因后，发现能够影响Th1细胞的分化，但是IFITM6的具体功能仍不清楚。

       IFITM作为固有免疫系统IFN效应的重要元件，在病毒性疾病的防御过程中发挥重要作用。由于IFITM参与调节机体的固有免疫，在病毒引起的疾病机制中具有重要作用。IFITM敲除的小鼠在Th2设计的免疫病理和应答中起保护作用。IFITM家族作为抗病毒治疗的有效靶点，能够抑制病毒入胞和复制，这对病毒感染相关疾病的预防和治疗提供可能的新的药物靶点。

1、基因信息

干扰素诱导膜蛋白6（interferon induced transmembrane protein 6 ，Ifitm6，GENE ID：213002），由IFITM6基因所编码，功能不明确，可能在Th2细胞的分化过程中起作用。

细胞：K562细胞（人类红白血病细胞系），源自一个53岁的女性慢性髓性白血病爆发期病人的淋巴母细胞。293T细胞，人肾上皮细胞系，同时表达 SV40 大 T 抗原。

2、实验动物背景信息

        实验所用小鼠（C57BL/6）背景。C57BL/6小鼠也被称为C57 black 6，也称作B6。1921年被培育出来，属于近交品系。该品系的最主要的两个特点就是品系稳定和易于繁殖。主要用途包括：作为生理学与病理学的实验动物模型、构建转基因动物模型、作为产生自发突变和诱发突变的同基因型小鼠的背景品系。该品系在国内使用频率高，价格相对便宜。

3、研究背景

在固有免疫系统中，IFITM作为固有免疫系统IFN效应的重要元件，在病毒性疾病的防御过程中发挥重要作用。除在固有免疫系统中发挥作用，IFITM家族还参与其他生理功能，如IFIMT5参与成骨细胞和矿物盐沉积。我们在前期工作中，通过造血干细胞的高通量测序和表达分析，筛选到基因IFITM6，表明该基因可能在造血干细胞的相关的生物学功能中发挥作用。IFITM6在小鼠造血干细胞中是否发挥作用，以及拥有怎样的生物学功能，需要进一步研究进行阐述。

目前尚没有IFITM6的基因敲除小鼠，构建该基因的敲除小鼠，分析该基因敲除后的表型以及在造血干细胞中的功能，该项目不仅为该基因在造血干细胞中的功能提供实验基础，同时也为该基因在病毒感染的先天性免疫机制研究中提供动物模型。

参考文献：

【1】  Yánez DC, Ross S, Crompton T. The IFITM protein family in adaptive immunity. Immunology. 2020 Apr;159(4):365-372. doi: 10.1111/imm.13163. Epub 2019 Dec 22.

【2】  Yánez DC, Sahni H, Ross S, Solanki A, Lau CI, Papaioannou E, Barbarulo A, Powell R, Lange UC, Adams DJ, Barenco M, Ono M, D'Acquisto F, Furmanski AL, Crompton T. IFITM proteins drive type 2 T helper cell differentiation and exacerbate allergic airway inflammation. Eur J Immunol. 2019 Jan;49(1):66-78. doi: 10.1002/eji.201847692. Epub 2018 Nov 9.

【3】  Smith S, Weston S, Kellam P, Marsh M. IFITM proteins-cellular inhibitors of viral entry. Curr Opin Virol. 2014 Feb;4:71-7. doi: 10.1016/j.coviro.2013.11.004. Epub 2014 Jan 28.

【4】  Shi G, Ozog S, Torbett BE, Compton AA. mTOR inhibitors lower an intrinsic barrier to virus infection mediated by IFITM3. Proc Natl Acad Sci U S A. 2018 Oct 23;115(43):E10069-E10078. doi: 10.1073/pnas.1811892115. Epub 2018 Oct 9.

【5】  Li K, Markosyan RM, Zheng YM, Golfetto O, Bungart B, Li M, Ding S, He Y, Liang C, Lee JC, Gratton E, Cohen FS, Liu SL. IFITM proteins restrict viral membrane hemifusion. PLoS Pathog. 2013 Jan;9(1):e1003124. doi: 10.1371/journal.ppat.1003124. Epub 2013 Jan 24.

【6】  Zhao X, Li J, Winkler CA, An P, Guo JT. IFITM Genes, Variants, and Their Roles in the Control and Pathogenesis of Viral Infections. Front Microbiol. 2019 Jan 8;9:3228. doi: 10.3389/fmicb.2018.03228. eCollection 2018.

【7】  Hickford D, Frankenberg S, Shaw G, Renfree MB. Evolution of vertebrate interferon inducible transmembrane proteins. BMC Genomics. 2012 Apr 26;13:155. doi: 10.1186/1471-2164-13-155.

【8】  Rodriguez Celin M, Moosa S, Fano V. Uncommon IFITM5 mutation associated with severe skeletal deformity in osteogenesis imperfecta. Ann Hum Genet. 2018 Nov;82(6):477-481. doi: 10.1111/ahg.12275. Epub 2018 Jul 24.

【9】  Lazarus S, McInerney-Leo AM, McKenzie FA, Baynam G, Broley S, Cavan BV, Munns CF, Pruijs JE, Sillence D, Terhal PA, Pryce K, Brown MA, Zankl A, Thomas G, Duncan EL. The IFITM5 mutation c.-14C > T results in an elongated transcript expressed in human bone; and causes varying phenotypic severity of osteogenesis imperfecta type V. BMC Musculoskelet Disord. 2014 Mar 27;15:107. doi: 10.1186/1471-2474-15-107.

【10】 Hanagata N, Li X, Morita H, Takemura T, Li J, Minowa T. Characterization of the osteoblast-specific transmembrane protein IFITM5 and analysis of IFITM5-deficient mice. J Bone Miner Metab. 2011 May;29(3):279-90. doi: 10.1007/s00774-010-0221-0. Epub 2010 Sep 14. 

二、制备方法

3.1 实验材料

3.1.1 实验动物

C57BL/6购自北京维通利华实验动物技术有限公司  SCXK(京）2016-0006。超排用雌鼠数量10-15只，年龄3周龄，交配传代用野生型鼠为成年8-10周龄小鼠。实验中基因工程小鼠由本实验室繁殖产生。实验中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为ZLF18004.

3.1.2 模型构建流程

         利用CRISPR/Cas9技术制备IFITM6敲除小鼠。选择敲除第二外显子，来构建IFITM6敲除小鼠 (B6. IFITM6 (tm)-GC/ILAS)。该基因敲除的杂合子小鼠，相互杂交可以获得该基因敲除的纯合子小鼠，使用PCR方法进行基因型鉴定。

3.1.3 IFITM6敲除小鼠的建立

3.1.3.1 IFITM6敲除小鼠模型的建立

  构建sgRNA 载体pUC57-sgRNA expression vector，根据基因信息选择靶点并合成sgRNA。

靶点1:

M- Ifitm6-EA1-g-up: TAGGACTGGGATCTGGTATAGG

M- Ifitm6–EA1-g-down: AAACCCTATACCAGATCCCAGT

靶点2:

        M- Ifitm6-EB1-g-up: TAGGGAGAATGCCCAGGGATTC

M- Ifitm6–EB1-g-down: AAACGAATCCCTGGGCATTCTC合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSA I线性化的载体，构建完成的sgRNA载体通过体外转录成为可注射的sgRNA。

 构建Cas9载体pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA。

显微注射

  1)  超数排卵：10-15只3周龄雌鼠注射激素进行超排。

  2)  受精卵注射：取约120枚受精卵进行注射。

  3)  受体鼠制备：8-10周龄雌鼠与结扎的SD雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。

  4)  胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部（移植一次，120枚卵，5只受体鼠）。

 基因型鉴定

  1)  剪尾编号：出生7-10天的乳鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。

  2)  基因组DNA提取：使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA

  3)  PCR检测：根据序列信息设计检测引物并进行PCR检测。

(6)   结果分析：选取通过PCR检测后含有不同于野生型分子量条带的鼠号，将PCR产物进行TA克隆，之后用检测引物进行菌液PCR，筛选有插入的克隆测序。

(7)   根据测序结果确定IFITM6敲除小鼠模型(B6. IFITM6 (tm)-GC/ILAS)用于后续实验。

3.1.3.2 动物繁殖和表达图谱分析

获得F0代后，首先通过与野生型鼠进行杂交，进行基因修饰鼠传代能力分析。获得能够传代的杂合子小鼠进行相互杂交，产生纯合敲除小鼠并用于后续实验。

3.1.3.3 鼠尾基因组DNA提取

在幼崽出生后剪脚趾标记，收集幼崽脚趾至1.5 mL EP管。然后参照DNA提取试剂盒（全式金）说明书按以下程序操作。

(1)   加入100 μL LB2和20 μL Proteinase K，55℃摇床孵育至完全裂解。

(2)   12000 rpm 离心5 min，转移上清于一无菌的离心管中。

(3)    加入500 μLBB2，立即涡旋5 s，室温孵育10 min。

(4)    将全部的溶液加入离心柱中，8000 rpm离心1 min，弃掉流出液。

(5)    加入500 μL CB2溶液，12000 rpm离心1 min，弃掉流出液。

(6)    重复步骤（5）一次。

(7)    加入500 μL WB2（使用前加入88 mL无水乙醇），12000 rpm 离心1 min，弃掉流出液。

(8)    重复步骤（7）一次。

(9)    10000 rpm 离心2 min，彻底去除残留的WB2。

(10)   将离心柱置于一干净的离心管中，开盖静置5 min，在柱的中央加入50~200 μL预热EB（60℃~70℃），盖上盖子，室温静置3 min，12000 rpm 离心2 min，洗脱DNA。保存至4℃冰箱。

三、生物安全性

模型制作及动物实验中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为ZLF18004。本实验部分使用了基因修饰动物（基因敲除），只在规定的SPF级动物设施内饲养，饲养过程有防逃逸的措施，如挡鼠板等。动物在离开动物设施后，进行完相关试验后，立即进行处死，取材。动物尸体暂存于-20℃冰箱中，经有资质的公司运走统一处理。

四、讨论和结论

该模型的鉴与评价技术方法和指标体系包括（1）分子水平：模型鼠基因型及mRNA表达应符合5.1和5.2中指标要求。（2）细胞水平：该基因过表达对细胞增殖影响应符合5.3中指标要求。（3）整体水平：模型小鼠造血干细胞对TBI和竞争性移植的影响应符合5.4、5.5中指标要求。。

在病毒感染引起的先天性免疫应答，IFITM家族在其中起重要作用，但是关于该家族在其他方面的研究相对较少。通过前期的大数据分析，发现IFIMT6可能在造血干细胞的发育分化、衰老过程中发挥作用，为探明该基因在造血干细胞中的作用和机制，我们建立了该基因的敲除小鼠模型，通过初步研究发现该基因缺失，在正常情况下，分析造血干细胞分化发育的各谱系细胞，并未发现明显差异，但是在TBI引起的造血干细胞损伤中起保护作用，并且通过竞争性移植实验发现该基因缺失，能够增强其竞争性能力，表明该基因缺失可能在外界刺激的情况下起保护作用，但是具体机制还需要进一步深入研究。

该基因敲除小鼠模型的建立，为该基因功能研究、病毒引起的先天性免疫应答研究、造血干细胞的功能研究等提供动物模型支撑。

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