2/3肝切除手术诱导小鼠肝再生模型

一、研究背景

肝病影响着全世界数百万人。在大多数发达国家，由于疾病预防、诊断和治疗方面的现代进步，病毒性肝炎的发病率正在下降。在包括中国在内的许多国家，扩大乙肝病毒系统免疫规划也大大降低了新病例数量。但是，随着生活水平的提高，包括非酒精性脂肪肝和酒精相关肝病在内的代谢性肝病的患病率逐渐上升，这些肝病最终可能导致更多的终末期肝病(肝功能衰竭、肝硬化和肝癌)的发生[9]。根据国际癌症研究机构2018年的一份报告，中国的肝癌发病率居世界第九位，仅次于蒙古、埃及、冈比亚、越南、老挝、柬埔寨、几内亚和泰国等少数发展中或新兴经济体。但从中国的人口规模来看，中国无疑是世界上肝癌患者最多的国家(2019年14亿)[10]。由于原发性肝癌早期缺乏明显的特异症状，常规的放疗和化疗的治疗效果无明显效果，肝脏病变部位切除是治疗的重要途径。如何有效地发掘肝脏再生潜能是术后病人得以存活的关键，因此，对肝脏的再生机理进行研究对于肝脏疾病的治疗具有重要的理论意义和临床应用价值。

2/3肝切除诱导的肝再生动物模型，最早是1931年由Higgins和Anderson在大鼠中使用，他们切除了大鼠四叶肝脏中的两叶（约占整个肝脏的2/3），用于研究肝脏再生。在后续的研究中因为大鼠比小鼠大，操作相对方便，所以大多数人选择大鼠进行肝再生的研究[11-14]。2003年时Greene和Puder为开发了一种新颖、快速且安全的小鼠部分肝切除技术[15]，他们确定了小鼠肝脏七个叶的相对贡献，并切出来左前叶、左后叶和右前叶切除，大约占总肝脏体积的68%。同时作者还将手术的麻醉方法改为异氟烷气体麻醉代替传统的三溴乙醇、氯胺酮和戊巴比妥，并把小鼠放在加热垫上防止小鼠体温流失，从而减少小鼠因手术引起的死亡。随后小鼠2/3肝切除技术逐渐成熟[16-18]。其中，2008年时 Claudia Mitchell 和 Holger Willenbring对小鼠2/3肝切除手术进行了进一步的改进：作者在进行肝叶切除时，将三步改成两步，首先切除小鼠肝脏的左后叶，再将小鼠的中间叶（左前叶和右前叶）一起切除，这种手术方法会将小鼠胆囊摘除[18]。2014年时该课题组对小鼠的镇痛、麻醉剂的选择及体温的控制也给出了如下补充：（1）为了防止麻醉下的小鼠体温过低，在整个手术过程中将小鼠放在暖垫上。（2）术后关闭腹膜后，在关闭皮肤前，将0.25% (wt/vol)盐酸布比卡因溶液(最大剂量8 mg/kg)滴于切口处。（3）术后使用盐酸丁丙诺啡0.1 mg/kg维持镇痛，之后每8-12小时注射一次，直到术后第2天结束[19]。后续关于小鼠肝再生模型的构建多采用以上两种方法。

二、制备方法

实验材料（实验动物、试剂、仪器）

动物：C57BL/6小鼠

试剂：异氟烷

器械及仪器：异氟烷汽化器、半弯曲显微手术剪、持针器、直头无齿微型解剖、弯头解剖镊、16cm直头组织剪、针托、回形针（用于自制拉钩）、棉签、酒精棉球、5ml注射器针头两个（固定拉钩）、医用胶布（固定小鼠）、聚苯乙烯泡沫塑料垫、1ml注射器（液体麻醉注射用）、3-0丝线（结扎肝叶）、4-0丝线（缝合腹膜）、缝合皮肤：订书机闭合/4-0尼龙线缝合

       实验环境

    动物手术在SPF动物实验室生物安全柜中操作。

       实验操作规程

1） 抓取小鼠，称重并记录。

2） 左手固定住小鼠，右手持装有适量异氟烷的麻醉装置，将小鼠的口鼻部暴露在异氟烷气体中。麻醉过程中应持续观察小鼠的反应，掌握好麻醉深度。

3） 待完全麻醉后，将小鼠固定在手术台上，术中持续给予吸入麻醉，维持适当的麻醉深度。用剃毛机剔除小鼠腹部的毛发，75%乙醇消毒后准备手术。

4） 在小鼠腹部靠近肝脏的位置，用剪刀沿着腹部中线将表面皮肤剪开一个小口（长度约为1.5-2.0cm），用镊子小心夹起小鼠腹膜，沿着刚才的切口将腹膜剪开，暴露腹腔，注意避开血管。

5） 用浸泡在PBS中灭菌过的棉签小心的将肝脏分离出来，用眼科剪剪断和肝脏相连的韧带，充分游离、暴露肝脏。

6） 用浸泡在PBS中的医用缝合线（5-0）从根部将小鼠左侧叶结扎，随即将该叶剪下。接着用同样的方法将中间叶一并结扎并剪下。操作过程注意动作轻柔，避免损伤其他肝叶，线要扎紧，避免脱落。

7） 用棉签将残余肝脏小心的送回至原有位置，随后依次用5-0和4-0的医用缝合线缝合腹膜和皮肤。缝好后，消毒缝合口和周围皮肤，停止麻醉。

8） 手术结束后将小鼠放在37度恒温加热垫上等待苏醒，最后将苏醒后的小鼠安置在干净的鼠笼中正常饲养、观察。

三、评价与验证

1、 细胞/基因/病原/蛋白表达/免疫组化 鉴定、病原学检查信息

2/3肝切除手术诱导的小鼠肝细胞增殖，通过H&E和BrdU染色可见术后小鼠肝脏细胞明显的增殖，统计肝重体重比也发现肝脏质量的恢复。

2、表型分析（包括生理生化、解剖学、生物学特征等）

大体解剖并未发现小鼠各脏器有明显异常。

3、影像/行为/临床/病理表型

模型小鼠的行为未出现明显异常。

评价方法：

 1）小鼠术后状态的恢复。

  通过观察小鼠活动状态及进食情况判断2/3肝切除手术术后小鼠整体健康状况是否恢复。

2) 肝脏细胞增殖及肝脏生长情况。

  该模型通过在术后不同时间点取材，一方面通过对小鼠肝脏质量和体重进行称重，统计肝重体重比，另一方面通过对肝脏组织进行病理染色判断肝脏细胞的增殖和肝脏的生长情况。

评价指标：

主要指标：

1）肝重体重比逐渐恢复。

2）肝脏细胞有丝分裂在增殖期显著增加。

3）肝脏细胞增殖在增殖期显著增加。

重要指标：小鼠活动、进食及体重变化。

四、生物安全性

本模型制作不涉及微生物。动物模型制备过程中遵循福利和各项管理度，并未传代，于SPF屏障环境下饲养，动物无逃逸。模型制备完成后，在进行病理染色析对环境和生态并未产明显影响。

五、讨论和结论

1、2/3肝切除诱导的肝再生模型的鉴定和评价的技术方法和指标体系主要分三个层面：

（1）整体水平：小鼠的整体健康状况良好，在术后各个时间点小鼠的肝脏质量能够逐渐恢复。

（2）病理水平：对肝脏组织进行病理学染色，检测肝脏细胞的增殖水平。

（3）分子水平：检测细胞周期相关基因mRNA和蛋白水平。

2、该模型主要是采用2003年时Greene和Puder开发的小鼠部分肝切除技术，结合后续不断改进的方法，增加镇痛剂加热垫等的使用。

3、该模型的整体操作过程相对比较简单，难点在于如何保持手法的一致性，以保证结果的差异不是由于操作上的不同引起的。肝细胞进入细胞周期并在组织丢失后再生的能力为研究肝细胞增殖和器官再生的调控提供了一个有效的模型，为终末期肝脏疾病需要行切除手术患者的术后治疗提供了更加丰富的理论研究基础，从而促进新的治疗手段的开发。

六、鉴定和评价的其他材料

参考文献：

1. Rodríguez, G., et al., A 70% hepatectomy in the rat using a microsurgical technique. Int Surg, 1999. 84(2): p. 135-8.

2. Krähenbühl, L., et al., Laparoscopic partial hepatectomy in the rat: a new resectional technique. Dig Surg, 1998. 15(2): p. 140-4.

3. Rozga, J., et al., A simple two-stage technique of total hepatectomy in the rat. J Surg Res, 1992. 52(1): p. 46-9.

4. Gaub, J. and J. Iversen, Rat liver regeneration after 90% partial hepatectomy. Hepatology, 1984. 4(5): p. 902-4.

5. Greene, A.K. and M. Puder, Partial hepatectomy in the mouse: technique and perioperative management. J Invest Surg, 2003. 16(2): p. 99-102.

6. Borowiak, M., et al., Met provides essential signals for liver regeneration. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101(29): p. 10608-13.

7. Martins, P.N., T.P. Theruvath, and P. Neuhaus, Rodent models of partial hepatectomies. Liver Int, 2008. 28(1): p. 3-11.

8. Mitchell, C. and H. Willenbring, A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat Protoc, 2008. 3(7): p. 1167-70.

9. Mitchell, C. and H. Willenbring, Addendum: A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat Protoc, 2014. 9(6).

10. Furukawa, T., et al., Nude mouse metastatic models of human stomach cancer constructed using orthotopic implantation of histologically intact tissue. Cancer Res, 1993. 53(5): p. 1204-8.

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