Stat5 敲除肠干细胞缺失小鼠模型

一、研究背景

1. STAT基因（细胞/基因/病原/其他造模因素）信息

STAT(信号转换器和转录激活因子)转录因子家族由STAT 1、3、4和5几种蛋白质组成。Janus激酶(JAK)/STAT信号通路与多种癌症如卵巢癌、横纹肌肉瘤、骨肉瘤和结肠癌相关。配体结合启动激活级联反应，最终导致STAT蛋白的磷酸化。磷酸化使STATs从细胞质转移到细胞核并具有转录活性。STAT蛋白的关键激活因子是干扰素、白细胞介素等细胞因子，以及转化生长因子(TGF) b等生长因子或癌基因等。

Stat5是信号转导和转录活化蛋白家族的重要成员，参与了Jak/Stat信号通路调控。Stat5能够影响细胞的增值/分化、存活与凋亡，并且在乳腺癌发育、免疫应答干细胞自我更新调控、造血作用以及肿瘤的发生发展中具有重要作用。

2.  研究背景

在哺乳动物体内，小肠组织是自我更新速度最快的组织之一。整个小肠黏膜大概每3~5d更新一次，主要依赖于小肠干细胞的增殖与分化。研究证实Ascl2、Olfm4、Bmi-1、Hopx等为小肠干细胞的标志基因。在这些标记基因中，Lgr5被认为是最重要的。从功能上分析，Lgr5编码G蛋白偶联受体，在Wnt信号通路中起着重要的作用。从数量上看，Lgr5+干细胞增殖活跃，具有自我更新的潜能，在所有隐窝的底部均大量存在，以维持小肠上皮的稳态。细胞因子- stat5信号通路调控可以调控肠上皮的稳态和损伤反应。我们通过特异性敲除肠道上皮细胞中的STAT5转录因子将STAT5信号通路与IESC的增殖分化联系起来。

二、制备方法

实验动物：Stat5 flox小鼠，Villin-CreERT2小鼠

试剂：tamoxifen(50mg/kg)，4%PFA

仪器：冰冻切片机，leica DMI8活细胞工作站

实验操作规程：将Stat5 flox小鼠与Villin-CreERT2小鼠杂交，在小鼠4周龄时，提取杂交小鼠鼠尾DNA，通过凝胶电泳检测小鼠基因型。STAT5基因PCR引物序列如下1. GAA AGC ATG AAA GGG TTG GAG 2.AGC AGC AAC CAG AGG ACT AC  3.AAG TTA TCT CGA GTT AGT CAG G ,Villin-CreERT2基因PCR引物序列如下:1 GTG TGG GAC AGA CAA ACC  2.ACA TCT TCA GGT TCT GCG GG。选取双阳性小鼠，6~8周龄，体重20~22g。按每只小鼠连续5天按50mg/ kg腹腔注射他莫西芬。诱导后CO2麻醉处死小鼠，取肠道组织，用冷PBS冲洗肠道组织，置于4%多聚甲醛中固定过夜，1×PBS溶液里浸泡5min。制作冰冻切片及石蜡切片，免疫组化及免疫荧光染色观察肠道干细胞的变化。

三、评价与验证

敲除肠上皮STAT5基因导致肠道干细胞减少

Western 结果显示STAT5基因敲除导致肠道干细胞减少

通过FACS分析敲除STAT5基因后干细胞数目明显减少，细胞增殖减少，模型建立成功。

四、鉴定和评价的其他材料

1.Liu R, Moriggl R, Zhang, et al. Constitutive STAT5 activation regulates Paneth and Paneth-like cells to control Clostridium difficile colitis[J]. Life Sci Alliance, 2019,2(2):296-316.

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