调节肠道干细胞分化基因小鼠谱系示踪模型

一、研究背景

谱系示踪技术是一种利用Cre-loxP 位点特异性重组系统对干细胞细胞子代分化命运进行追踪展示的方法，用于揭示特定类型干细胞在组织发育、疾病和再生中自我更新、分化和转分化的现象。谱系示踪系统可以追踪来源于同一干细胞的所有子代细胞，是在成体哺乳类组织中研究干细胞特性的一种重要工具，通常使用Cre-LoxP系统，需要两种品系小鼠：一种是具有组织或细胞特异性的Cre重组酶小鼠，另一种是带有loxP-STOP-loxP（锚定STOP）序列的报告基因小鼠。通过他莫西芬诱导可在两种品系杂交后的双阳性子代小鼠特定细胞内表达Cre重组酶，以此剪切STOP序列，从而使报告基因得以表达，获得遗传基因改变的细胞，进而达到示踪的目的.
       具体来讲：在含有CreER的转基因小鼠中，CreER由于在特定的启动子驱动下，表达在特定的细胞类群中，当CreER 小鼠与Rosa26（Rs）ER位点含有loxP 的报告基因（floxed基因）小鼠交配时，CreER 通过识别loxP 位点之间的终止序列切除，从而使含有RsCreER 的细胞类群表达出报告基因。由于这种切除使DNA水平上的，所以是永久不可逆的，因此，利用该细胞示踪踪技术可以解析特定细胞的起源和命运。
       研究背景
       细胞因子激活酪氨酸蛋白激酶（JAK） /信号转导和转录活化因子（STAT） 5 是几乎所有肠道细胞因子，生长因子和生长激素下游转录活化因子 。去除或减少 STAT5 能够导致胚胎干细胞，造血干细胞，肝干细胞，髓样干细胞，以及乳腺干细胞分化异常和组织功能障碍 。
       我们实验室报道了敲除肠上皮 STAT5 导致 Lgr5+ IESC 再生障碍，上皮屏障缺失，增加肠炎易感性 。相反， 短暂的 STAT5 酪氨酸磷酸化（pYSTAT5） 能够增加Lgr5+肠干细胞再生，保护肠道，减轻实验性肠炎。 但是， STAT5 是否能够调节 IESC 内源性的转录、激活因子，调节何种上游细胞因子以及诱导何种肠上皮分化，还未见报道。因此我们使用特定的 Stat5 复合基因工程小鼠与Lgr5CreER-GFP-RstdToamtoCreER 小鼠，进行肠上皮细胞分化的谱系追踪来确定持续性的 pYSTAT5 激活能够诱导肠道干细胞分化为何种细胞类型。

二、制备方法

实验动物：Lgr5-EGFP-CreERT2小鼠，ROSA26-tdTomato小鼠，Stat5 或 icS5 floxed小鼠

    试剂：tamoxifen(100mg/kg)，4%PFA

    仪器：冰冻切片机，leica DMI8活细胞工作站

实验操作规程：将Lgr5-CreGFP;RstdToamto-CreER 小鼠系与Stat5 或 icS5 floxed小鼠杂交，分别为对照组（Lgr5-CreGFP;RstdToamto-CreER）；实验1组（Lgr5-CreGFP；RstdToamto-CreER;Stat5）；实验2组（Lgr5-CreGFP；RstdToamto-CreER;icS5）。在小鼠4周龄时，提取杂交小鼠鼠尾DNA，通过凝胶电泳检测小鼠基因型。Lgr5基因PCR引物序列如下(扩增目的片段长174bp)。Common 8060：5'-CTGCTCTCTGCTCCCA GTCT-3'；Wild Type 8061：5'-ATACCCCATCCCTT TTGAGC-3'；Mutant 9402：5'-GAACTTCAGGGTC AGCTTGC-3'。PCR条件：预变性94℃3min；94℃变性30s，66℃复性1min，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。选取双阳性小鼠，6~8周龄，体重20~22g。实验组小鼠按100mg/kg体重腹腔注射他莫昔芬，对照组小鼠注射等量的玉米油。通过 Tam 诱导， 然后分别在 12 小时和 1, 3, 5, 7, 30， 122和280天麻醉处死各组小鼠。分别取结肠、空肠、回肠组织，用冷PBS冲洗肠道组织，纵向剖开，放入多聚甲醛中固定过夜，制作冰冻切片在子代肠上皮细胞中追踪检测是否去除 Stat5 或活化 STAT5 能够改变肠上皮中的tdToamto 信号强度和位置. 

三、评价与验证

在显微镜下观察诱导后不同时间点小肠干细胞的变化，发现诱导后3d隐窝底部已经开始出现荧光，并有向上移动的趋势； 诱导后5d荧光细胞已经移动到隐窝的快速增殖细胞(TA)部； 诱导后7d可看到有少量从隐窝分裂分化的细胞已经移动到绒毛顶端；诱导后14d有更多的荧光细胞到达小肠绒毛顶端，少量绒毛从隐窝基底到绒毛顶尖则全部带有荧光；诱导后45d可见整个小肠绒毛中荧光细胞更多、 更密实。 提示分化的细胞系来源于Lgr5 +干细胞， 小鼠小肠干细胞谱系追踪模型成功建立。

四、鉴定和评价的其他材料

Liu R, Moriggl R, Zhang, et al. Constitutive STAT5 activation regulates Paneth and Paneth-like cells to control Clostridium difficile colitis[J]. Life Sci Alliance, 2019,2(2):296-316.

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