他莫昔芬诱导型KPC小鼠模型

一、制备方法

此 Kras^LSL-G12D;p53^LoxP;Pdx1-CreER 三重突变品系通过以下三种单重突变品系杂交获得：

B6.129S4-Kras^tm4Tyj/J（品系货号 008179）

B6.129P2-Trp53^tm1Brn/J（品系货号 008462）

Tg(Pdx1-cre/Esr1*)#Dam/J 品系（品系货号 024968）

对于Kras^tm4Tyj 等位基因[Kras^LSL-G12D]，研究人员精心设计了靶向载体，将 G12D点突变置于基因外显子1上，并将两侧有loxP位点的终止元件置于突变的上游位置。终止元件在5'端以相反方向整合PGK-嘌呤霉素选择原件。将腺病毒强剪接受体（通常用于基因诱捕载体）融合在his3填充片段的上游位置，以防止在终止子周围剪接（如果转录未完全沉默）。突变剪接供体位点位于3'端和SV40 PolyA四聚体串联阵列上。终止子的设计与基因组Sal1或Xho1位点刚好匹配。终止信号原件会阻止突变体 Kras表达，直至该信号原件被Cre介导的重组除去后，致癌Kras方能表达。该构建体电转化入源自129S4/SvJae的J1胚胎干(ES)细胞。捐赠实验室将此品系小鼠与C57BL/6小鼠回交10代以上，并使用5'端和3'端外源和内源探针，通过Southern印迹检测验证了方向的正确性。

对于Trp^53tm1Brn突变 [p53^LoxP或p53^flox]，研究人员使用靶向载体在基因的1号和 10号内含子两侧导入了loxP位点。使用源自IB10/E14IB10 129P2/OlaHsd的胚胎干细胞系创建突变，之后将小鼠与C57BL/6回交八代。

对于Tg(Pdx1-cre/Esr1*)#Dam转基因[Pdx1-CreER]，将Cre-ER^TM序列（Cre 重组酶与小鼠雌激素受体配体结合域 G525R 突变体融合）导入小鼠 Pdx1 的启动子 ATG，然后导入SV40多聚腺苷酸化信号。将转基因载体注入B6CBAF1胚胎。所得小鼠一开始先与远交ICR或CD1小鼠杂交，之后再与C57BL/6小鼠回交。 与ICR/CD1和 C57BL/6小鼠的后续杂交使得该品系成为混合遗传背景。

二、评价与验证

此KPC品系为他莫昔芬诱导胰腺导管腺癌(PDAC)模型小鼠，携带Kras LSL G12D (Kras^tm4Tyj)等位基因、Trp53^tm1Brn floxed等位基因和Tg(Pdx1-cre/Esr1*)#Dam转基因。KPC品系小鼠在他莫昔芬给药后8-10周内出现腺泡导管化生和胰腺上皮内瘤变(PanIN)，并在14-16周内进展为浸润性胰腺导管腺癌。 其时程和转移扩散（至肝、肺、腹膜壁层和隔膜）与在PDAC的KPC模型中观察到的表型相似。 胰腺组织学分析显示，其多灶性肿瘤类型与KPC模型中所见的肿瘤类型相同。

Kras^tm4Tyj等位基因[Kras^LSL-G12D]包含点突变(G12D)，但是因为存在loxP终止密码子，该突变表达受阻。此Kras^tm4Tyj等位基因纯合小鼠会出现宫内死亡。Cre 介导的重组可以切除终止密码子，使致癌蛋白得以表达。

Trp53^tm1Brn等位基因[p53^LoxP]在P53基因2至10号外显子的两侧包含LoxP位点。Trp53^tm1Brn等位基因纯合小鼠生育能力虽有所降低，但仍可育种。Cre介导的 floxed序列缺失会导致等位基因敲除。

Tg(Pdx1-cre/Esr1*)#Dam 转基因[Pdx1-CreER]具有小鼠Pdx1启动子，能够表达他莫昔芬诱导型Cre重组酶（Cre-ER^TM；Cre重组酶与小鼠雌激素受体配体结合域的 G525R 突变体融合）。

如针对品系货号024968小鼠所述，该Pdx1-CreER转基因纯合小鼠可存活且有生育能力。免疫组化分析结果证明，转基因表达与内源性Pdx1模式关联密切。该转基因表达可见于胰腺的腺泡、胰岛和导管细胞，但未见于间充质细胞（源自内皮和间充质的平滑肌细胞）。到E10.5，胰腺上皮中可检出较高的Cre表达。

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