Nature | 单细胞测序绘制小鼠多组织衰老图谱！

  文章摘要：

  衰老表现为生理完整性的进行性丧失，导致功能受损，更容易死亡。尽管近年来发展迅速，但衰老过程中的许多分子和细胞过程仍不清楚。为了更好了解这些过程，本研究创建了一个横跨小鼠寿命周期的单细胞转录组图谱，其中包括来自23个组织和器官的数据。发现了多种细胞类型和器官的细胞特异性变化，以及不同器官细胞组成的年龄相关的变化。利用单细胞转录组数据，我们能够评估不同衰老特征的细胞类型特异性表现，如衰老、基因组不稳定性和生物体免疫系统的变化。关于衰老的最重要的标志是如何在广泛的组织和细胞类型中反映的，Tabula Muris Senis提供了丰富的新的分子信息。

  研究设计及概述

  作者使用了两种单细胞测序技术：基于微滴（Droplet，10x Genomics）和流式细胞分选（FACS，Smart-seq2）

  动物及分组：雄性19只，雌性11只，C57BL/6JN小鼠，6个年龄组（1个月、3个月、18个月、21个月、24个月、30个月）。

  组织来源：膀胱、骨髓、脑（小脑、皮质、海马、纹状体）、脂肪（棕色、性腺、肠系膜、皮下）、心脏、主动脉、肾脏、大肠、肢体肌肉、膈肌、肝脏、肺脏、乳腺、胰腺、皮肤、脾脏、胸腺、舌、气管。

图1 单细胞测序样品来源

总共检测了529,823个细胞，其中110,824个细胞来源于流式分选，245,389个细胞来源于微滴法。通过自动注释（70%）并人工审核、手动注释（30%），作者最终建立了被称为Tabula Muris Senis的小鼠衰老细胞图谱，最终得到了54个亚群。

图2 所有样本降维聚类结果

衰老既表现出细胞类型比例变化，又表现出同一类型细胞中基因表达变化

膀胱细胞比例随年龄逐步下降，而膀胱上皮细胞比例则随年龄逐步上升，肾脏的多种内皮细胞、上皮细胞比例均随着年龄逐步下降，脾脏浆细胞比例随年龄上升，而脾脏T细胞则随年龄呈现出比例下降趋势。乳腺的T细胞、骨髓的B细胞、皮肤的表皮干细胞也随年龄呈现出比例下降趋势。

图3 各类细胞随年龄的比例变化

Cdkn2a目前已被认为明确与衰老相关，被广泛用于衰老的标记物。在本研究中同样证实，流式法和微滴法均表面随着鼠龄增增大，Cdkn2a阳性比例显著升高。

图4 Cdkn2a阳性细胞比例在各组中变化

在各类细胞中同样存在基因表达差异，共性的如E2F2、Lmnb1、TNF和ITGAX表达与鼠龄增加呈正相关，而对延缓衰老起重要作用的Sirt家族成员Sirt3、 Sirt4和 Sirt5等则呈负相关。

图5 各组织中与年龄相关的基因

各组织的基因及细胞随年龄变化

膀胱：间质性的细胞组分下降，上皮性的细胞比例上升。差异基因显示，基质相关基因（Col1a1, Col1a2, Col3a1, Dcn）下降，而上皮相关基因（Krt15, Krt18, Sfn）上升。内皮比例下降（相关基因Htra1、Fos下调）与组织血管生成下降相关。白细胞比例上升，提示局部微环境呈促炎状态，与文献报道膀胱过度活动一致。膀胱白细胞表现出促炎相关因子Cd14、Lgals3、Tnfrsf12a升高而抗炎相关分子Cd9、Cd81下降。

肾脏：肾小球系膜细胞、微血管内皮细胞、髓襻升支及降支上皮细胞比例下降。Egf和Atp1a1表达随年龄升高下降，这与肾小球滤过率下降有关。此外，发现尿调理素（uromodulin，又称Tamm–Horsfall蛋白）丰度随着年龄增长而下降。

脾脏：T细胞比例随年龄增长而下降，而浆细胞数量则相对增加。在乳腺中也发现出类似的现象。T细胞的下降已被发现与感染性疾病、癌症等相关。

肝脏：随年龄增长，肝脏免疫相关分子表达升高（H2-Aa, H2-Ab1, H2-D1, H2-Eb1, Cd74, Lyz2）。肝脏Kupffer细胞中Clec4f 表达不随年龄变化，然而，当与Ilb共染时，Clec4f和Il1b共表达随年龄升高。特异性敲除肝细胞IL1受体，可减轻创伤导致的细胞死亡，提示Kuffer细胞上的I1b升高与不良预后相关。在肝脏内的免疫防御方面，窦状内皮细胞（LSECs）发挥着独特的作用，是肝脏中甘露糖受体（Mrc1）的主要载体。研究结果发现，在Kupffer细胞中，Mrc1的年龄相关表达增加，而在肝脏内皮细胞中，Mrc1的总表达随着年龄的增长而减少。通过对Mrc1和经典的LSEC标记物Pecam1进行原位RNA染色发现，表达LSECs的Mrc1的数量随着年龄的增长而增加。既往发现LSECs在老年肝脏中内吞能力降低，这些结果表明LSEC基因特征随年龄的变化与其在免疫反应中的功能密切相关。

体细胞突变随年龄积累

基因组不稳定性是衰老的特征之一，使用基因组分析工具包（Genome Analysis ToolKit，GATK）39同时对所有FACS样本进行SNP分析，观察到分析的所有器官中与年龄相关的突变数量增加，舌和膀胱受影响最大。

图6 体细胞突变随年龄积累

衰老使得小鼠免疫系统对新病原体的反应性下降

衰老同样影响免疫系统，研究分析了B细胞和T细胞的克隆关系，利用单细胞和TraCeR分别计算重建了流式细胞仪数据中B细胞的B细胞受体（BCR）和T细胞受体（TCR）序列，发现3个月时大多数细胞都不是克隆型（仅9％是克隆家族的一部分 ），克隆型B细胞数量在18个月时比3个月翻了一番，从18个月到24个月又翻了一番（约38％）。在T细胞方面，随年龄增长T细胞库的克隆性增加。这种的克隆性的变化表明衰老使得小鼠免疫系统对新病原体的反应性下降。这再次证实了前人的发现：与年轻的人相比，老年人有较高的易感性，且接种疫苗后获得的抗性更低。

图7 衰老对免疫的影响

大脑和肾脏的免疫系统细胞随年龄的变化最显著

最后，作者通过计算总体多样性评分，发现源自大脑和肾脏的免疫系统细胞随年龄的变化最显著。在脑小胶质细胞中，与大多数年轻的小胶质细胞相比（3个月，占据亚群1和6），年老的小胶质细胞（18个月和24个月，主要占据构成簇10、12和14中）中主要的组织相容性复合体（MHC）I类基因（H2-D1，H2-K1和B2m）、退行性疾病相关的基因以及促炎基因（Oasl2，Oas1a，Ifit3，Rtp4，Bst2，Stat1，Irf7，Ifitm3，Usp18，Ifi204和Ifit2）上调。

肾脏巨噬细胞则分为两群，其组成随年龄显着变化，群10主要由1月龄和3月龄的年轻细胞组成，群13主要由老年细胞（18、21、24、30月龄）组成。差异基因表达分析显示（图6），群10表达M2-巨噬细胞基因集，包括Il10、H2-Eb1、H2-Ab1、H2-Aa、Cd74、C1qa、Cxcl16、Hexb、Cd81、C1qb和Cd72等，而群13类似于M1-促炎性巨噬细胞状态，富集Hp、Itgal、Msrb1和Gngt2等。

总结

Tabula Muris Senis提供了详细的分子和细胞类型的衰老图谱，提供了表型和生理学的深层特征，并为理解哺乳动物在其生命周期中所经历的细胞生物学变化的许多方面提供了参考。

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