在过去的几十年里，人类遗传学的进步导致了许多与疾病相关的遗传变异的发现。追踪疾病遗传原因的一种行之有效的方法是选择性敲除动物体内的单个基因，并研究其对生物体的影响。但随着研究深入，越来越多的证据表明，许多疾病并不只是单个基因异常导致的，而是多个基因共同作用的结果。这使得科学家很难确定任何一种基因与疾病的相关程度。要做到这一点，科学家必须进行许多动物实验——每一种所需的基因修饰都要进行一次实验，这无疑给研究带来了巨大困难。与人类病理学相关的遗传变异的概要不断增长，需要新的方法以高通量的方式研究复杂组织中的基因型-表型关系。近日，瑞士苏黎世联邦理工学院（ETH Zurich）领导的研究团队开发出一种方法，将大大简化和加速实验动物研究：借助CRISPR-Cas技术，研究人员同时在单个动物的不同细胞内进行不同的基因改造，让每个细胞中只有一个基因被改变，且器官中的不同细胞以不同的方式改变。这使得研究人员能够在一次实验中研究过去需要进行多次动物实验的内容。利用这种新方法，研究人员发现了与严重罕见遗传病相关的基因。相关研究于9月20日发表在《Nature》上，题为Transcriptional linkage analysis with in vivo AAV-Perturb-seq”。
首次在成年动物身上
苏黎世联邦理工学院的研究人员首次成功地将这种方法应用于活体动物，特别是成年小鼠。为了正确指引小鼠细胞CRISPR-Cas基因剪刀应该剪除哪些基因，研究人员开发了一种名为AAV-Perturb-seq筛选技术，这是一种腺相关病毒介导的直接体内单细胞CRISPR筛选方法。研究人员使用了腺相关病毒（AAV），使每个病毒颗粒携带靶向特定基因的信息，然后用携带不同基因靶向指令的混合病毒感染小鼠大脑，实现在所需的基因和细胞中进行基因编辑。通过这种方式，能够敲除一个器官中不同细胞中的不同基因。研究人员指出，目前的CRISPR筛选方法主要使用慢病毒，仅限于体外应用，而且只适用于这种病毒可以感染的组织。他们认为，迫切需要适用于不同组织的体内单细胞筛选，这也是他们选择AAV的原因，因为AAV可以静脉注射，靶向更大范围的组织和细胞类型。AAV-Perturb-seq让人们有机会直接分析同一动物体内多个细胞类型中的多个基因，而不受组织或发育时间点的限制，为研究体内的健康和病变过程提供了更多可能。
发现新的致病基因
利用该新技术，研究人员研究了一种罕见人类遗传疾病——22q11.2缺失综合征，系统地剖析了成年小鼠大脑前额叶皮层 22q11.2 缺失综合征的基因-表型图谱，获得了22q11.2缺失综合症的发病机制新线索。22q11.2缺失综合征是由22号染色体上一个小片段的缺失引起。每 4000 个新生儿中就有一个会受到影响，通常会导致心脏问题、免疫缺陷和认知问题等症状。受这种疾病影响的患者通常被诊断为精神分裂症和自闭症谱系障碍等。根据过往的研究，科学家已经确认一个含有106个基因的染色体区域与这种疾病有关但不清楚具体哪些基因有关键作用。在小鼠实验中，研究人员重点关注了该染色体区域的29个基因（这些基因在小鼠大脑中都很活跃），他们使用AAV-Perturb-seq新技术在小鼠不同脑细胞中分别敲除了这29个基因的某一个，然后进一步分析这些脑细胞的RNA水平变化。研究发现，涉及已知和以前未描述的通路的Dgcr8、Dgcr14、Gnb1l和Ufd1l基因的扰动导致了转录变化。在22q11.2缺失综合征小鼠模型中观察到的基因表达变化中，这些基因的联合作用占高达40%。
进一步的分析表明，这些基因影响与神经元功能有关的各种生物学途径。DGCR8、DGCR14 和 GNB1L 可能通过广泛改变体内与疾病易感性相关基因的表达，并通过一种涉及成熟神经元中 RNA 调节的机制，对 22q11.2缺失综合征起作用。这些发现揭示了这种综合征患者神经元功能障碍的潜在因素，并表明可能直接逆转成熟神经元中基因表达的一些变化。总的来说，该研究结果表明，DGCR8、DGCR14和GNB1L可能对22q11.2缺失综合征有影响，它们通过调控成熟神经元的RNA广泛改变体内与疾病易感性相关基因的表达。研究人员下一步将确定在发育期间或之后恢复DGCR8、DGCR14、GNB1L和UFD1L的表达是否能挽救22q11.2缺失综合征相关的神经元和认知表型。
科学家想要确定哪个基因在多大程度上与疾病有关，是一件非常困难的事，往往需要反反复复地实验。但如果能对动物细胞逐个展开精准编辑，科学家就能够“一次顶多次”——于一项实验中收获多个基因变化的影响结果。现在，研究人员将其变为可能，并已在小鼠实验中同时实现了高精准和高效率，这为人们未来追踪和治疗更多遗传类疾病开辟了全新路径。此外，该研究还建立了AAV-Perturb-seq作为体内基因型-表型景观转录连锁分析和系统转录谱分析的强大方法。AAV-Perturb-seq可用于研究遗传元素在广泛的发育时间点、组织和细胞类型的高通量筛选中的作用，这可以增加对许多健康和疾病状况的了解。Randall Platt研究小组的博士生、本研究的第一作者António Santinha说："如果我们知道某种疾病的哪些基因具有异常活性，那么我们就可以尝试开发补救这种异常的药物。”他同时强调这一方法也可以用于研究其他的疾病，加速让我们认识更多疾病背后的深层机制。Santinha说：“许多先天性疾病由多个基因共同起作用，如精神分裂症等精神疾病。现在，我们的技术使我们能够直接在成年动物身上研究此类疾病及其遗传原因。我们现在可以在活体生物中进行这些分析，这是一个很大的优势，因为细胞在培养过程中的行为与它们作为活体的一部分的行为是不同的。另一个优势是，科学家只需简单地将 AAV 注射到动物的血液中即可，AAV有多种不同的功能特性，在这项研究中，研究人员使用了一种进入动物大脑的病毒。不过，根据你想要研究的内容，你也可以使用针对其他器官的 AAV。”
Transcriptional linkage analysis with in vivo AAV-Perturb-seq，DOI: 10.1038/s41586-023-06570-yGenetically modifying individual cells in animals，https://www.eurekalert.org/news-releases/1001848
