江西中医药大学/深圳市人民医院等联合发表14.6分Top期刊，揭示迷迭香酸通过调控氧化应激与炎症改善糖尿病肾病肾损伤的单细胞机制

糖尿病肾病（DN）是糖尿病最常见的微血管并发症之一，氧化应激与炎症紊乱是其核心发病机制，严重威胁患者肾功能及生存预后。迷迭香酸（RA）作为天然酚酸类化合物，已被证实具有抗炎、抗氧化活性，但在 DN 中的单细胞水平作用机制尚未明确。江西中医药大学、深圳市人民医院等联合团队通过单细胞转录组测序、蛋白质组学及分子生物学技术，系统解析了 DN 小鼠肾脏的细胞异质性及 RA 的干预效应。研究发现，RA 可显著减轻近端肾小管 S1 段及足细胞损伤，抑制 S100a4 + 促炎巨噬细胞募集，改善自然杀伤细胞（NK 细胞）免疫功能紊乱，并通过调控关键配体 - 受体对重塑细胞间通讯网络。该研究从单细胞层面阐明了 RA 改善 DN 肾损伤的分子机制，为 RA 的临床转化及 DN 的精准治疗提供了重要实验依据。

本研究以 “解析迷迭香酸（RA）在糖尿病肾病（DN）中的单细胞水平作用机制” 为核心目标，设计了系统的实验方案。首先，构建 DN 小鼠模型，将实验动物分为正常组（Normal）、DN 模型组（DKD）、RA 治疗组（DKD_RA）及二甲双胍阳性对照组（MET），经过 39 天干预后，收集小鼠肾脏组织、血液及尿液样本，进行生化指标检测（如血尿素氮、肌酐、尿白蛋白 / 肌酐比）和组织病理学分析（H&E、Masson 染色），验证 RA 对 DN 小鼠肾功能及肾组织损伤的改善效应。

其次，采用肾脏组织单细胞分离技术获取单细胞悬液，通过 10×Genomics 单细胞转录组测序构建三组小鼠肾脏的单细胞图谱，鉴定肾脏细胞谱系及亚型，分析 DN 诱导的细胞组成变化及 RA 的调控作用。利用 Seurat 软件进行差异基因（DEG）分析，结合 clusterProfiler 进行 GO/KEGG 功能富集，明确 RA 调控的关键生物学通路；通过 SCENIC 分析转录因子活性，CellChat 解析细胞间通讯网络。

同时，采用无标记 LC-MS/MS 技术进行蛋白质组学分析，鉴定差异表达蛋白（DEPs），并通过 Western blot 验证核心炎症因子（IL-1β、NF-κB）的表达变化，从转录和蛋白水平双重验证 RA 的作用机制。

最后，聚焦关键细胞类型（近端小管 S1 段、足细胞、巨噬细胞、NK 细胞），深入分析 RA 对其损伤、氧化应激及炎症反应的调控效应，整合多组学数据，系统阐明 RA 改善 DN 肾损伤的细胞特异性机制。

肾脏单细胞图谱构建与细胞组成变化：成功构建了 Normal、DKD、DKD_RA 三组小鼠肾脏的单细胞图谱，鉴定出 13 种细胞谱系（包括近端小管、足细胞、巨噬细胞、NK 细胞等）。DKD 组近端小管（PT）细胞比例显著升高，升支粗段（ALH）、集合管主细胞（CD-PC）、足细胞（Podo）等比例下降，RA 治疗可部分逆转上述细胞组成异常，且显著减轻肾小管上皮空泡变性等病理损伤。

关键细胞类型的特异性响应：①近端小管（PT）分为 S1、S2、S3 亚型，DKD 组 S1 亚型损伤及炎症评分最高，RA 下调 S1 亚型中氧化应激（Atoxl、Sod2）、炎症（Il1b、Ccl4）相关基因表达，抑制促炎转录因子活性；②足细胞在 DKD 组中炎症及损伤评分最高，RA 显著下调其细胞趋化、氧化应激相关基因，改善足细胞损伤；③巨噬细胞分为 4 亚型，DKD 组 S100a4 + 促炎巨噬细胞募集增加，RA 可减少其比例并下调促炎基因表达；④NK 细胞在 DKD 组中细胞毒性及炎症评分升高，RA 可改善其免疫功能紊乱。

分子机制与通路调控：RA 挽救了 DKD 小鼠肾脏中氧化应激、炎症相关差异基因（如 Nfkbl、Il1b、Atoxl）的异常表达，富集通路包括 TNF-α/NF-κB 信号、氧化磷酸化、凋亡等；蛋白质组学验证显示，RA 下调 DKD 组中炎症、氧化应激相关蛋白表达，Western blot 证实 IL-1β、NF-κB 蛋白水平显著降低。

细胞间通讯网络重塑：DKD 组中 S100a4 + 巨噬细胞、NK 细胞与其他细胞的通讯强度显著增强，RA 治疗后减弱；RA 下调免疫抑制配对（Cd274-Pdcd1）及促炎趋化因子配对（Ccl6-Ccr2、Ccl5-Ccr5）的通讯概率，重塑肾脏免疫微环境。

构建了正常小鼠（Normal）、糖尿病肾病模型小鼠（DKD）、迷迭香酸治疗组小鼠（DKD_RA）的肾脏单细胞测序及蛋白质组学实验流程；H&E 染色显示 DKD 组小鼠肾小管上皮出现空泡变性，RA 治疗后损伤减轻；通过单细胞测序鉴定出 13 种肾脏细胞谱系（近端小管、足细胞、巨噬细胞等），其中近端小管（PT）占比最高（73.33%）；DKD 组 PT 细胞比例从 63.78% 升至 76.26%，升支粗段（ALH）、集合管主细胞（CD-PC）等比例下降，RA 治疗可部分逆转上述细胞组成改变。

差异基因（DEG）分析显示，RA 治疗后近端小管（PT）和升支粗段（ALH）的差异基因数量最多，且多数差异基因具有细胞特异性，体现细胞异质性；RA 挽救了氧化应激（Atoxl、Abcal）和炎症相关基因（Nfkbl、Il1b）的异常表达；功能富集分析显示，RA 挽救的基因富集于 TNF-α/NF-κB 信号、氧化磷酸化、凋亡等通路；足细胞（Podo）的氧化应激模块评分最高，中性粒细胞（Neutro）和巨噬细胞（Mo）的炎症模块评分最高。

近端小管（PT）差异基因富集于代谢过程、氧化应激等通路；PT 可分为 S1、S2、S3 三个亚型，DKD 组 S2 亚型比例增加、S1 亚型减少，RA 治疗可逆转该变化；S1 和 S3 亚型的损伤标志物（C3、Myc）及炎症评分显著高于 S2，且 S1 亚型损伤评分最高；DKD 组 S1 亚型损伤评分显著升高，RA 治疗后显著降低，蛋白质组结果验证了损伤标志物的表达变化；RA 下调 S1 亚型中氧化应激（Atoxl、Sod2）、炎症（Il1b、Ccl4）相关基因表达，抑制促炎转录因子（Rara、Nfkb2）活性。

将肾脏其他上皮细胞重聚类为 9 个亚型（包括足细胞、远曲小管等）；DKD 组足细胞（Podo）比例下降，炎症及损伤评分在所有亚型中最高；DKD 组足细胞差异基因富集于炎症反应、细胞趋化等通路，RA 治疗后这些通路显著下调；RA 抑制足细胞中细胞趋化（Syk、Ccl9）、氧化应激（Gas5、Ncf1）及损伤标志物（Vcaml、Lcn2）的表达；蛋白质组分析显示，DKD 组炎症、氧化应激相关通路上调，RA 治疗后显著逆转。

巨噬细胞重聚类为 4 个亚型（Gpx3+Mo、Cd86+Mo、S100a4+Mo、Cd163+Mo），其中 S100a4+Mo 富集缺氧及炎症相关基因（S100a4、Il1b）；DKD 组 S100a4+Mo 比例增加、Cd86+Mo 比例下降，RA 治疗可逆转该趋势；RA 下调 Cd86+Mo 和 S100a4+Mo 中促炎（TNF-α/NF-κB 信号）、氧化应激相关基因表达；RA 降低促炎转录因子（Hif1a、Stat3）活性，蛋白质组及 Western blot 验证 IL-1β、NF-κB 等炎症因子表达减少。

将 T 细胞、B 细胞及 NK 细胞重聚类为 8 个亚型；DKD 组 T_C1、T_C2 及 NK 细胞比例增加，RA 治疗后显著降低；NK 细胞的细胞毒性及炎症模块评分在所有亚型中最高，RA 治疗后显著改善；RA 下调 NK 细胞中炎症相关基因（Cd48、Ccl5）表达；功能富集显示，RA 治疗后 NK 细胞中免疫反应正调控通路上调，凋亡、细胞黏附调控通路下调。

DKD 组 S100a4 + 巨噬细胞与集合管主细胞、NK 细胞等的通讯强度显著增强，RA 治疗后减弱；DKD 组 NK 细胞与中性粒细胞、Cd86 + 巨噬细胞的通讯增强，RA 可逆转该变化；鉴定出 10 个关键配体 - 受体对，DKD 组免疫抑制相关配对（Cd274-Pdcd1、Cd86-Ctla4）及促炎趋化因子配对（Ccl6-Ccr2、Ccl5-Ccr5）的通讯概率升高，RA 治疗后显著下调。

参考文献

https://doi.org psb.2024.01.003

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