小分子量蛋白该如何做好WB

通常而言，蛋白条带的分子量越小，就越容易展现出向四周扩散的态势，甚至可能完全无法看到条带。之所以如此，是因为分子量越小的蛋白，其能够结合的 SDS 数量也越少。在电场的作用下，蛋白在向前迁移的过程中会向四周扩散，最终无法呈现出相应的蛋白条带。小分子量的蛋白做好WB，也是个世纪难题！

    如果蛋白分子量过小，可参考以下方法做好WB：

• 上样量：上样量建议选择50-100μg，80%蛋白在细胞中的含量很低，当蛋白分子量过小时，上样量选择50-100μg。

• 凝胶电泳：选择合适胶浓度，分子量小的蛋白，建议配置5%的浓缩胶，分离胶浓度可参考下表。

• 转膜：免疫印迹中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF膜等。针对不同分子量的蛋白质，PVDF 膜有两种规格：0.45 μm 的膜适合检测 MW ＞ 20 kDa 的蛋白质，0.22 μm 的膜适合检测MW ＜ 20 kDa 的蛋白质，而且0.22 μm 的膜可以有效防止蛋白质在转移过程中直接穿透过膜。当穿透严重时，可以用两张0.22μm膜叠加使用。PVDF 膜使用之需要在甲醇中浸泡 5min 后再转入转移液中，PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合。

• 转膜时间：建议减少转膜时间，降低转膜的电压电流，200mA-250mA转15-30min。
  

• 转膜后：用丽春红染色，测定蛋白丰度。PVDF膜经丽春红染色后，观察目的条带的染色情况，根据条带的染色情况调整抗体的稀释倍数。

• 一抗的稀释比例：通常抗体的说明书上都会给出一定的稀释比例，对于分子量过小的蛋白来说，可根据说明书适当调整稀释比例。

• 显影要把握曝光时间：根据信号的强弱适当调整曝光时间。

    以下便是有关小分子量蛋白 WB 实验的部分经验之谈与建议，但愿能够为那些仍受小分子量蛋白 WB 所困扰的朋友们提供助力。正如古人云：“他山之石，可以攻玉。”愿这些建议能成为大家实验成功的“他山之石”。