环磷酰胺诱导小鼠免疫抑制模型

      1 动物分组与模型制备    幼年（3周龄，10 g左右）、青年（8周龄，22 g左右）、老年（14月龄，30 g左右）雄性C57BL/6J小鼠（SPF级）各32只。CTX组成年鼠、老年鼠腹腔注射环磷酰胺100mg/kg，分两次隔天给药，50mg/kg/次。幼年鼠腹腔注射环磷酰胺剂量为72mg/kg【同种动物间剂量换算公式：Dose(b)=Dose(a)×(Wb/Wa)2/3,W为体重(Kg)】，分两次隔天给药，36mg/kg/次。对照组腹腔注射等剂量生理盐水。分别于给药后第3天，7天，2周，4周检测各年龄小鼠造血免疫指标。

      2 主要试剂与仪器   NK1.1 ，CD11b， F4/80，CD4，CD25，Foxp3抗体；Foxp3 Buffer Set，CD8a，B220抗体。注射用环磷酰胺。小鼠ELISA试剂盒。137Csγ射线照射源，GAMMA-CELL40，剂量率0.80Gy/min。流式细胞仪，全自动血液分析仪，酶标仪MK3

      3 模型评价方法

      3.1 外周血血常规检测     给药后第3天、7天、2周、4周，小鼠眼内眦取血，EDTA-K3 抗凝，用全自动血细胞计数仪测定白细胞数（WBC）、淋巴细胞数、淋巴细胞百分比、中性粒细胞百分比。

      3.2 器官指数测定    小鼠称重后取小鼠胸腺、脾脏称重，计算胸腺、脾脏指数（器官指数=器官重量（mg）/小鼠体重（g））。

      3.3 外周血IgA、IgG、IgM测定    取10ul抗凝血浆，稀释10000倍备用。复孔加入50ul 1×检测缓冲液和50ul 2倍倍比稀释的标准品。15分钟内，样本孔加入90ul 1×检测缓冲液和10ul预稀释的样本。室温孵育2小时。洗涤后每孔加入100ul稀释的检测抗体。室温孵育1小时。洗涤后每孔加入100ul显色底物，避光，室温孵育5-30分钟。每孔加入100ul终止液。在450nm波长检测OD值。

      3.4 外周血淋巴细胞分型测定    每管取50ul抗凝血，按照流式表面染色方法分别标记CD4/CD8a和NK1.1/ F4/80/B220/CD11b。室温避光孵育30min，加入1ml 红细胞裂解液，室温裂解10min。1000r/min离心5min后弃上清，缓冲液洗涤1次后加入300ulPBS，4°C保存待检。用流式细胞仪检测NK细胞、巨噬细胞（CD11b+F4/80+）、B细胞、CD4+T细胞，CD8a+T细胞比例。外周血B220细胞，CD4+T细胞，CD8a+T细胞绝对数计算方法：细胞数（109/L）=B220细胞，CD4+T细胞，CD8a+T细胞在总细胞中占比×淋巴细胞数。

      3.5 脾脏淋巴细胞分型测定    制备脾细胞悬液，调整细胞浓度为10^7 /ml，取100ul 细胞悬液加到EP管中。按照流式表面染色方法标记CD4/B220/CD25。4°C避光孵育30min，加入1ml 红细胞裂解液，室温避光裂解10min。1000r/min离心5min后弃上清，缓冲液洗涤一次，离心完全弃上清。分别使用Foxp3 Fixation/permeabilization buffer，permeabilization buffer 处理细胞，按照流式表面染色方法标记FOXP3，室温避光孵育20min。1000r/min离心5min后弃上清，缓冲液洗涤1次后加入300ulPBS，4°C保存待检。用流式细胞仪检测B细胞、Treg细胞(CD4+CD25+FOXP3+)比例。

      3.6 胸腺淋巴细胞分型测定    制备胸腺细胞悬液，调整细胞浓度为10^7 /ml，取100ul 细胞悬液加到EP管中。按照流式表面染色方法标记CD4/ CD8。4°C避光孵育30min，1000r/min离心5min后弃上清，缓冲液洗涤1次后加入300ulPBS，4°C保存待检。用流式细胞仪检测CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+CD8+T细胞比例。

      3.7 统计学方法    采用Prism5软件处理数据、作图。各指标间两组实验数据的比较采用t检验，数据以均数±标准差（`X±s）表示。