CTLA4人源化小鼠模型

一、研究背景

    1、CTLA4基因信息

小鼠CTLA4基因位于第一号染色体的1C2区段（Chromosome 1: 60,887,000-60,915,832，ENSMUSG00000026011）

人CTLA4基因位于2q33.2。

2、实验动物背景信息

c57bl/6小鼠也被称为c57 black 6，1921年被培育出来，属于近交品系。该品系的最主要的两个特点就是品系稳定和易于繁殖。另外c57bl/6小鼠是第一个完成基因组测序的小鼠品系。

3、研究背景

       细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 (cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA4)（CD152）和CD28是表达在CD4 +和CD8 + T细胞的同源受体，两者共享在抗原呈递细胞表面表达的一对配体，并且在T细胞活化中介导相反的功能。配体与CD28相互作用，介导T细胞与T细胞受体（TCR）信号共刺激。而配体与CTLA4的相互作用可以介导T细胞功能的抑制[1]。目前，癌症免疫疗法已成为治疗癌症的有效方法，CTLA4是经过验证的免疫检查点的靶标之一[2]。由于CTLA4功能的重要性，因此在许多临床前和临床研究中都对anti-CTLA4抗体及[3]CTLA4阻滞剂进行了癌症治疗的测试[4-10]。人类和小鼠的CTLA4只具有75.16％的同源性，目前批准用于临床的抗CTLA4抗体可以与人CTLA4结合，但不会与鼠类CTLA4交叉反应[11]。因此，构建免疫检验点人源化小鼠模型，使科研人员能够研究只识别人体免疫检验点的药物。并且，人源化小鼠为研究靶定人体免疫检验点的检验点抑制剂提供了可能性，并且在临床试验前更精准的预测药物功效以及可能的副作用（如自身免疫，促炎症等）。

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二、制备方法

模型构建流程：利用CRISPR /Cas9 技术，建立CTLA4基因人源化小鼠模型，利用PCR、RT-PCR和Western Blot 的方法进行鉴定及分析。

载体构建：

1. sgRNA 载体

载体名称：pUC57-sgRNA expression vector

Addgene ID: 51132

根据基因信息选择靶点，合成sgRNA（上海英潍捷基）

targeting site 1:

gggttcaaacacatctca    agg

m-ctla4-gRNA up1      5’TAGGgggttcaaacacatctca

m-ctla4-gRNA down1    5’aaacTGAGATGTGTTTGAACCC

targeting site 2:

gagacttctggaacatgg    aGg

m-ctla4-gRNA up2      5’TAGGgagacttctggaacatgg

m-ctla4-gRNA down2    5’aaacCCATGTTCCAGAAGTCTC

合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSAⅠ线性化的载体

构建完成的sgRNA载体通过体外转录成为可注射的sgRNA。（体外转录用试剂盒：Ambion  Am1354）

2，CAS9 载体

载体名称：pST1374-NLS-flag-linker-Cas9

Addgene ID: 44758

载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA（体外转录用试剂盒：Ambion  Am1345）

显微注射：

1、超数排卵：15只3-4周龄c57雌鼠注射激素进行超排。

2、受精卵注射：取约150枚受精卵进行注射。

3、雄鼠结扎：制作30只8周龄输精管结扎的c57雄鼠。

4、受体鼠制备：8-10周龄ICR雌鼠与结扎的ICR雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。

5、胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部（移植一次， 120枚卵，4只受体鼠）。

基因型鉴定：

1、剪尾编号：出生7-10天的乳鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。

2、基因组DNA提取： 使用全式金（Transgen）公司的基因组DNA提取试剂盒（EE101-12）提取基因组DNA

3、PCR检测：根据序列信息设计检测引物（上海英潍捷基）

M-CTLA4-KO-S    5’AGAAATTATACTCTCCAAGACTCCACG    

M-CTLA4-KO-A    5’CCTTAAGTCCCAGCTGAGATCC     

KO：

TM=62℃       WT：727bp    ko: (见测序分析)

PCR反应体系及扩增程序（TaKaRa RR042A）

反应体系：

扩增程序：

6×loading buffer 终止反应。

用1%的琼脂糖凝胶进行电泳。

4、结果分析： 选取PCR检测分子量不同于野生型条带的 (下图中箭头所示)，将PCR产物进行TA克隆，之后用检测引物进行菌液PCR，筛选有插入的克隆测序。

5、测序结果：

KI：3#，5#，9#，14#，23#

黄色绿色为检测引物，蓝色字体为同源序列，红色为H-CTLA4基因ORF，灰色为BGH poly A

ctaccactgagctacatctatacctctgagctgtgtcttcattgctgaggtatatgaactacgtctctatcactgagctgtgcctccaagttttaagtttctacctttgaaaatttttactattttttttaaaagcccatcctcctgtggaggttttaaatgtcttttcatttggattgactttctctgggccatccacaactttattttgccgttgttacagttttaaaagcatctggtttatttcccaacggacaaaaccagaggcccctttccctgttttgtgtgtgtgtgtttgtgtgtgcatatgtgtgcatgcatgtgcatgtacaaatgtgtgtgtgtctttcatttcttgtgattttggcatttttctctcagtaaaatactaagtggagttaggcaaaaataaacccttttgtgtactgaggggctcatagaaggacacaatttttcttggtgccttccaaagagaaattcagacatcagctccaggactaagagggatggccatgggacgctaagtaagagtactgggggattaaagatgaccagatgactggataaagttgggactgggatttagggattccttgtactacagaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaAgcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccgccaccatggcttgccttggatttcagcggcacaaggctcagctgaacctggctaccaggacctggccctgcactctcctgttttttcttctcttcatccctgtcttctgcaaagcaatgcacgtggcccagcctgctgtggtactggccagcagccgaggcatcgccagctttgtgtgtgagtatgcatctccaggcaaagccactgaggtccgggtgacagtgcttcggcaggctgacagccaggtgactgaagtctgtgcggcaacctacatgatggggaatgagttgaccttcctagatgattccatctgcacgggcacctccagtggaaatcaagtgaacctcactatccaaggactgagggccatggacacgggactctacatctgcaaggtggagctcatgtacccaccgccatactacctgggcataggcaacggaacccagatttatgtaattgatccagaaccgtgcccagattctgacttcctcctctggatccttgcagcagttagttcggggttgtttttttatagctttctcctcacagctgtttctttgagcaaaatgctaaagaaaagaagccctcttacaacaggggtctatgtgaaaatgcccccaacagagccagaatgtgaaaagcaatttcagccttattttattcccatcaattgaCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaaggaaccatgagagttccttaagtcccatatgggggagaacaagttctttgtcactgctagaaaatcctgtaaagttaagagatttaaggggggcatttgaaatcgtgagtacatttgatcttgatatcacagtaacattaaggtttttctccttacccccaatcccacccccaaaacttacctaaattcaaataaataagaagttttcctcattcactttaagattttgagacactcttagttctttaaattatcacacctaaggcttaggggacatagcagaagagggggcagaaagactatgagagccaaaggtacatagagtttactgagagattgtgtctcttaggatgtcaaatggtacacccataaagtctcaccaacacgactgcctaaacttgagctgaataaggacatgaataacaatagacatacccaagtggatggggaaagaccaagatgcttcagcactatagcaataactacaggaagccaaggaatatggagagtaggaaattgccaagggaaaagcacaccagctgactatccaataa

3.1.5.2 动物繁殖和表达图谱分析

获得F0代后，首先通过与野生型C57小鼠进行杂交，进行基因修饰小鼠传代能力分析。之后CTLA4敲除小鼠通过杂合子与杂合子杂交，获得CTLA4敲除小鼠纯合子小鼠，进行蛋白表达分析，并用于后续实验。

3.1.5.3 鼠尾基因组DNA鉴定

在幼崽出生后剪脚趾标记，并剪尾至1.5 mL EP管。然后参照鼠尾直接PCR试剂盒（bimake）说明书按以下程序操作。

       1.1. 按小鼠数量配制组织消化液，试剂比例如下：

       组织消化液现用现配，充分混匀后使用。

       1.2. 向每个含有样本的EP管中加入100 μL新鲜组织消化液，55℃水浴/金属浴中消化15 min。组织消化时，务必将组织完全浸没于消化液中。消化完成后，组织外观上仍然完整，但足量的基因组DNA已经释放，不影响后续的PCR实验。

       1.3. 将样本置于95℃水浴/金属浴中孵育5 min以灭活消化液中的蛋白酶活性。12000 rpm离心5分钟，取上清作为PCR模板。消化后的上清或连同组织的消化液可于-20℃保存三个月。

       2. PCR扩增

       2.1. PCR反应体系：

2.2. PCR反应条件：

3. 琼脂糖凝胶电泳

      试剂2 x M-PCR OPTITM Mix中含有溴酚蓝染料，PCR产物可直接点样进行琼脂糖凝胶电泳。

三、评价与验证

4.1CTLA4人源化小鼠模型的建立

将F0代小鼠与C57小鼠进行杂交，获得杂合子hCTLA4 h/m,将杂合子互交并将子代进行基因型鉴定，得到纯合敲入小鼠hCTLA4 h/h。

注：使用PCR鉴定子代小鼠基因型，突变可传代。M：Marker（TaKaRa，DL2000）；H: 水。h/h：CTLA4人源化纯合子小鼠；h/m：ctla4人源化杂合子小鼠；m/m：野生型小鼠。

4.2 CTLA4人源化小鼠组织中蛋白及mRNA表达

为了鉴定转基因小鼠是否在蛋白水平发生CTLA4人源化，取1-2月龄小鼠脾、肺进行Western Blot，分别使用种属反应性为小鼠、大鼠和人，以及种属反应性为人的CTLA4抗体检测蛋白表达。结果显示，市售的种属反应性为人的CTLA4抗体无法区分人源与鼠源的蛋白。

因为市售蛋白抗体无法区分人源与小鼠源CTLA4蛋白，使用RT-PCR鉴定人源化小鼠脾细胞（CD3抗体刺激4天）中mRNA表达。结果可见人特异性引物（hCTLA4-F: 5’CCCTGCACTCTCCTGTTTTTTCT，hCTLA4-R: 5’TTGATTTCCACTGGAGGTGCC）只能扩增纯合子hCTLA4 h/h的cDNA，而小鼠特异性引物（mCTLA4-F: 5’CCTTTTGTAGCCCTGCTCACT, mCTLA4-R: 5’TTCACTCTGCTTTCATTAAAGGTAC。）也只能扩增hCTLA4 m/m的cDNA，可见ctla4人源化转基因小鼠中只表达人源CTLA4的mRNA。

注：m/m：野生型小鼠；h/h：CTLA4人源化纯合子小鼠。a：Western Blot 检测CTLA4蛋白在脾和肺中的表达，CTLA4：种属反应性为小鼠、大鼠和人的CTLA4抗体，；hCTLA4：种属反应性为人的CTLA4抗体。b：RT-PCR检测CTLA4 mRNA在脾中的表达，

4.3 人源CTLA4基因可正常替代小鼠CTLA4基因

文献报道，CTLA4基因敲除小鼠会由于严重的自身免疫疾病，在出生后3-4周内死亡。但在CTLA4人源化小鼠中，没有观察等到淋巴细胞的浸润，并且根据我们的观察结果表明，纯合的CTLA4人源化小鼠寿命正常，在10个月内没有观察到自身免疫性疾病发展的迹象。因此，在纯合的CTLA4人源化小鼠中，人源CTLA4等位基因已功能性替代了小鼠CTLA4基因。

注：hCTLA4^m/m（a-f）及hCTLA4^h/h（g-l）小鼠的心、肝、脾、肺、肾、胸腺中无明显淋巴细胞浸润。图中显示的是心脏（a，g）、肝（b，h）、脾（c，i）、肺（d，j）、肾（e，k）、胸腺（f，l）的组织切片HE染色。比例尺=100μm。

4.4 人源化CTLA4基因小鼠免疫系统正常。

我们利用流式细胞术检测了野生型小鼠和人源化CTLA4基因小鼠外周血中各类细胞的比例，发现其外周血中B细胞（B220+）、T细胞（CD3+、CD4+、CD8+）、粒细胞（CD11b）和NK细胞的比例都没有明显差异。同时检测骨髓、脾脏和胸腺等免疫器官中免疫细胞的比例发现人源化CTLA4基因的小鼠和野生小鼠相比没有差异。结果说明人源化CTLA4基因后没有改变正常生理状态下小鼠免疫系统的组成。

注：m/m：野生型小鼠；h/h：CTLA4人源化纯合子小鼠。a：流式细胞术统计不同免疫细胞在外周血中的比例。B-E：流式细胞术检测不同免疫细胞的直方图。

四、生物安全性

模型制作及动物实验中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为BL18003。本实验部分使用了基因修饰动物（基因敲入），只在规定的SPF级动物设施内饲养，饲养过程有防逃逸的措施，如挡鼠板等。动物在离开动物设施后，进行完相关试验后，立即进行处死，取材。动物尸体暂存于-20℃冰箱中，经有资质的公司运走统一处理。

五、讨论和结论

抗体疗法是很受关注的免疫疗法之一，在研究治疗性抗体的效果时，可以使用免疫系统人源化小鼠进行研究。如使用免疫缺陷小鼠进行人外周血重构，从而在小鼠中建立功能正常的人免疫系统。虽然这种模型可以用于筛选抗体的潜在抗癌作用，但在评估其它临床参数，如自身免疫性方面受到一定限制。并且免疫系统人源化小鼠容易产生移植物抗宿主病，或需要人细胞因子刺激使移植后的细胞存活增殖。相比之下，CTLA4基因人源化小鼠的免疫应答是在自然环境中产生的。并且，CTLA4基因人源化小鼠模型可以用于评估与潜在人类治疗性抗体相关的自身免疫副作用的能力。

因此，本研究建立的CTLA4人源化小鼠模型改善了CTLA4在人与小鼠中种属差异导致的实验结果差异，从而使药物评价的结果更加客观，为治疗性抗体的验证提供了更有价值的实验动物模型。

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