骨髓移植小鼠模型

一、研究背景

1、造模因素信息

本模型受体小鼠须接受致死剂量电离辐射。

电离辐射是指携带足以使物质原子或分子中的电子成为自由态，从而使这些原子或分子发生电离现象的能量的辐射。电离辐射的特点是波长短、频率高、能量高。电离辐射可以从原子、分子或其他束缚状态中放出（ionize）一个或几个电子。电离辐射是一切能引起物质电离的辐射的总称，其种类很多，高速带电有α粒子、β粒子、质子，不带电粒子有中子以及X射线、γ射线。本实验中使用的小动物专用的X射线、γ射线照射设备。

2、实验动物背景信息

C57BL/6J小鼠，携带CD45.1和CD45.2等位基因。分别作为供体小鼠和受体小鼠。

3、研究背景

1961年加拿大科学家James Till和Ernest McCulloch在为收到射线照射后小鼠输注骨髓细胞后发现了小鼠脾结节，提出了造血干细胞的基本特征，奠定了造血干细胞生物学的基础。此后各国科学家为分离纯化造血干细胞以及检测造血干细胞功能及调节机制，研究造血干细胞移植相关临床问题进行了广泛的研究。骨髓移植实验成为检测造血干细胞自我更新和分化的能力的金标准。携带CD45.1和CD45.2等位基因的C57BL/6J小鼠培育成功为广泛应用竞争性骨髓移植实验提供了物质基础。

1. Li C, Lu L, Zhang J, Huang S, Xing Y, Zhao M, Zhou D, Li D, Meng A. Granulocyte colony-stimulating factor exacerbates hematopoietic stem cell injury after irradiation. Cell Biosci. 2015 Nov 25;5:65. doi: 10.1186/s13578-015-0057-3. eCollection 2015

2. Zhang H, Zhai Z, Wang Y, Zhang J, Wu H, Wang Y, Li C, Li D, Lu L, Wang X, Chang J, Hou Q, Ju Z, Zhou D, Meng A. Resveratrol Ameliorates Ionizing Irradiation-Induced Long-Term Hematopoietic Stem Cell Injury in Mice. Free Radic Biol Med., 2013, 54:40-50

3. Zhang J, Yang R, Zhou D, Rudolph KL, Meng A, Ju Z. Exonuclease 1 is essential for maintaining genomic stability and the proliferative capacity of neural but not hematopoietic stem cells. Stem Cell Res. 2014 , 12(1):250-9. 

4. Hétu-Arbour R, Bouali S, Heinonen KM. Experimental Competitive Bone Marrow Transplant Assays. Methods Mol Biol. 2021;2185:195-214.

5. Cheng H, Liang PH, Cheng T. Mouse hematopoietic stem cell transplantation. Methods Mol Biol. 2013;976:25-35. 

二、制备方法

1. 实验动物 雄性 C57BL/6J-Ly-5.1 (Ly5.1) 小鼠购自实验动物科学研究所（PUMC，北京，中国）；C57BL/6J J（Ly5.2）小鼠购自Vital River（中国北京）。小鼠 8-12 周龄，体重 20-25 克。

2. 试剂  流式检测用抗体均是eBioscience产品。

3. 动物模型建立方法

3.1 移植前准备：小鼠饲养于SPF级动物房内，垫料高温消毒，隔日更换，饲料经⁶⁰Co照射灭菌，饮水为过滤的无菌水；

3.2 全身照射：C57BL/6J-Ly-5.2受体小鼠在接受骨髓移植前接受致死剂量的放射线照射。采用X或γ射线做全身照射，剂量率0.5-1Gy/min，总剂量9Gy（亦可分两次照射，每次剂量4.5Gy，间隔时间2~5小时，以减少放射线对器官的损伤）；

3.3 供体小鼠骨髓细胞的分离：从C57BL/6J-Ly-5.1小鼠骨骼中冲出骨髓有核细胞作为供体细胞，将细胞浓度调至2×10⁷ 个/ml；

3.4 制备植入细胞混合液：将从 C57BL/6J-Ly-5.1小鼠中收集的细胞与同样方法收集的C57BL/6J-Ly-5.2小鼠按1：1混合；

3.5 移植：将制备的植入细胞混合液通过眼后静脉丛或尾静脉注射注入全身照射处理后的C57BL/6J-Ly-5.2受体小鼠，每只受体小鼠接受注射液体总量控制在200-300µl。含单个核骨髓细胞约1×10⁶个； 

3.6 移植后受体给予抗生素一周。饮水中添加乳酸左氧氟沙星0.5mg/ml，建议药物使用注射液剂型，以避免药物阻塞饮水口。移植后注意饮食饮水补给，以提高移植成活率。

三、评价与验证

在骨髓移植后1个月、3个月分别采血，应用流式细胞仪分析外周血中供体细胞嵌合率：在EP管中加入抗凝剂0.1M EDTA 10ul，从眼后静脉丛取血30ul，标记抗体，使用staining medium调整染色体积50ul，冰上孵育30min。（4色以上，同时配备单一抗体染色对照管）。每管加入1ml BD Pharm Lyse裂解红细胞，室温孵育5-10min，1500rpm/min 离心5min。弃上清，加入1ml staining medium洗一遍；200ul重悬，上机检测不同分型造血免疫细胞中45.1和45.2细胞的比例。

模型评价方法：在移植后1个月、2个月（或者3个月）采集外周血，流式方法检测供体造血细胞的嵌合率。1个月时嵌合率在70~80%；2~3个月时嵌合率是40~50%。

四、生物安全性

在制备模型过程中，使用的辐照仪是自屏蔽的。使用时有自动安全保护设置，周围环境是安全的。

五、讨论和结论

    造血干细胞是最早发现和鉴定的干细胞，是研究干细胞生物学功能及其调节的范式。也是研究各种疾病病理生理机制及预防治疗措施的重要模型。竞争性骨髓移植模型在造血干细胞功能研究及骨髓移植相关问题研究中应用广泛。

移植过程中，应注意一些实验细节。移植前受体小鼠的清髓一般选择致死剂量照射， C57BL/6J 背景小鼠一般照射总剂量为9.0 Gy，可分2次照射，每次照射剂量为4.5 Gy，中间间隔2 h。照射后2 h 左右进行群体细胞注射，其移植成功效率更高。一般选择2.5 × 10⁵ 受体同源的全骨髓细胞作为保护细胞，保护细胞数量过多会降低供体来源细胞的检出效率，过少则无法保证致死剂量照射小鼠短期的存活。

六、鉴定和评价的其他材料

1. Li C, Lu L, Zhang J, Huang S, Xing Y, Zhao M, Zhou D, Li D, Meng A. Granulocyte colony-stimulating factor exacerbates hematopoietic stem cell injury after irradiation. Cell Biosci. 2015 Nov 25;5:65. doi: 10.1186/s13578-015-0057-3. eCollection 2015

2. Zhang H, Zhai Z, Wang Y, Zhang J, Wu H, Wang Y, Li C, Li D, Lu L, Wang X, Chang J, Hou Q, Ju Z, Zhou D, Meng A. Resveratrol Ameliorates Ionizing Irradiation-Induced Long-Term Hematopoietic Stem Cell Injury in Mice. Free Radic Biol Med., 2013, 54:40-50

3. Zhang J, Yang R, Zhou D, Rudolph KL, Meng A, Ju Z. Exonuclease 1 is essential for maintaining genomic stability and the proliferative capacity of neural but not hematopoietic stem cells. Stem Cell Res. 2014 , 12(1):250-9. 

咨询电话： 400-6988-095